樊二勤 刘彩霞 付鹏跃 杨传平 曲冠证

(林木遗传育种国家重点实验室，东北林业大学，哈尔滨 150040)

木质素是维管植物中的重要大分子物质，与纤维素、半纤维素纵横交错形成次生细胞壁[1～2]。木质素不但对维管运输和植物机械支撑起重要作用，而且在植物对环境适应及抵抗生物和非生物胁迫过程中发挥作用[3～8]。木质素作为木材的主要组成成分，在林木的生长发育过程中具有非常重要的作用。木质素是复杂的苯丙烷类单体聚合物，通常是由3种单体聚合而成，3种单体分别为p-coumaryl(H型，20)，coniferyl(G型，22)和sinapyl(S型，24)alcohols(图1)。在双子叶植物中，木质素主要是由S型，G型和少量的H型以及其它中间的代谢产物聚合而成[9]。在杨树中，S型和G型木质素单体比值大约为2∶1[10]。

图1 杨树中各种酶参与的木质素单体的合成途径Fig.1 Synthetic pathway of lignin monomer involved in various enzymes in poplar

木质素是苯丙烷代谢途径的重要产物之一，在生物合成中涉及到许多重要的酶参与。其中对-香豆酸3-羟化酶(p-coumarate 3-hydroxylase,C3H)属于细胞色素P450单氧化酶，是在对-香豆酰辅酶A(p-coumaroyl CoA)到咖啡酰辅酶A(caffeoyl CoA)的羟基化过程和G/S单体形成中的关键控制酶类[11]。2001年Schoch和Franke等从拟南芥中分离并定位到C3H基因，证明C3H有可能是木质素合成中重要的中间代谢物质[12～13]；Abdulrazzak等人又获得拟南芥突变体，其生长发育受到抑制，木质素组成也与REF8基因突变体相似，进一步证明了CYP98A3为编码C3H的基因。

一直以来，国内外对C3H作为关键的木质素合成调控酶的研究集中在草本植物和裸子植物上，主要是提高纸浆获得率及饲料消化率[14～18]，而对于林木中的C3H研究甚少，为探究其在杨树中的表达模式，本文以84K杨为研究对象，通过探究PagC3H3基因在84K杨不同组织中的特异性表达来解析该基因的表达模式；再者，启动子是调控基因表达的重要组成部分，克隆启动子序列是了解基因表达模式及调控机制的关键，目前对杨树中C3H基因启动子的功能研究报道较少，本文根据已公布的杨树基因组，从84K杨中克隆PagC3H3基因的启动子序列，构建到植物表达载体上，瞬时侵染拟南芥，GUS染色表明该启动子具有时空特异性表达的特征，同时表明该启动子调控PagC3H3基因在木质素合成中发挥作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

野生型拟南芥(ArabidopsisthalianaCol-0)和84K杨(Populusalba×P.grandulos)均为本实验室保存。

1.2 菌株及主要试剂

大肠杆菌(Esherichiacoli)Trans1-T1感受态购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司；根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受态购自上海唯地生物技术有限公司；pBI121载体由本实验保存；pEASY-T1 Clonging Vector购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自杭州博日科技(Bioer)有限公司；RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术(BioTeke)有限公司；反转录试剂盒、qPCR试剂、限制性内切酶、LATaq酶、dNTP Mixture、DNA Ligation Kit、DNA Marker等均购自TaKaRa公司(大连)；其他实验试剂均为进口或国产分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 84K杨PagC3H3基因组织特异性表达分析

为了检测84K杨PagC3H3基因在不同组织的表达水平，选取温室内长势基本一致，株高为1.2 m的3株五月龄84K杨，分别取顶芽、顶部茎节、中部茎节、基部茎节、幼叶、功能叶、根7个组织部位。利用BioTeke公司通用植物总RNA提取试剂盒对84K杨不同组织的Total RNA进行提取，操作方法参照试剂盒说明书。利用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒将质量完好的84K杨不同组织的Total RNA反转录为cDNA，并将反转录后的cDNA稀释5倍作为定量PCR检测的模板，以毛果杨Ptractin基因作为内参基因，引物序列如下：Ptractin-RT-F(5′-AATACCCCATTGAGCACGG-3′)/Ptractin-RT-R(5′-ACTCACACCATCACCAGAATC-3′)，检测目的基因在不同组织的表达量，所用的定量PCR引物为：PagC3H3-RT-F(5′-TCAGGCTACTTCCATTTGGTG-3′)/PagC3H3-RT-R(5′-AATTTCCTCTGGCTTCACTCC-3′)。反应程序按照机器(Applied Biosystems 7500)设置进行，反应完成后，将定量PCR数据导出，利用2-ΔΔCt法计算目的基因的表达量。

1.3.2 84K杨PagC3H3启动子的克隆

根据Phytozome网站上公布的毛果杨基因组信息，查找PtrC3H3基因上游的启动子序列，设计特异性引物，引物序列如下：PagC3H3-pro-F(5′-ATCAAGCTTCGTGTCAATTTATTCAACATTCTTAC-ACACAC-3′)/PagC3H3-pro-R(5′-ATCTCTAGATGTGGAGAGAAAAAATAAAAATTGGAAGAGAAAG-GG-3′)。以84K杨组培苗叶片为DNA提取的材料，利用本实验室改良的CTAB法[19]提取84K杨基因组DNA，根据设计好的引物进行目的片段的扩增，PCR程序结束后将PCR产物全部进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，利用胶回收试剂盒对目的条带进行切胶回收，并根据操作手册将纯化后的片段连入pEASY-T1载体中，转化大肠杆菌感受态(Trans1-T1)，对获得的单克隆进行PCR检测，获得条带大小与目标一致的阳性克隆，并送至擎科生物公司进行测序检测，将测序检测正确的阳性克隆命名为pEASY-PagC3H3-promoter。

1.3.3 pBI121-PagC3H3pro::GUS载体构建及瞬时转化

将测序正确的单克隆，在液体LB培养基中扩大培养，利用Bioer公司的质粒提取试剂盒分别对pEASY-PagC3H3-promoter和pBI121这两种载体进行质粒提取，利用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切，并分别胶回收目的片段，利用TaKaRa公司的DNA Ligation Kit连接酶进行连接并转化大肠杆菌感受态(Trans1-T1)，对获得的单克隆进行PCR检测，获得条带大小与目标一致的阳性克隆，并送至擎科生物公司进行测序检测，将阳性克隆命名为pBI121-PagC3H3pro::GUS。选取测序验证正确的菌液提取质粒，转化农杆菌GV3101感受态，并对转化农杆菌长出的单克隆进行PCR验证。

瞬时转化方法过程如下：培养2周龄的拟南芥幼苗放到OD600=0.3且含有1/2MS、40 μmol·L-1AS、0.002 mg·L-1TDZ的农杆菌侵染液中，于28℃，180 r·min-1摇床中共培养2 d[20]。

瞬时转化拟南芥的组织特异性观察：对2 d后的拟南芥进行GUS染色观察，具体步骤如下：将瞬时转化完成后的拟南芥转移到GUS染液中，避光，抽真空处理，使其中的气体全部溢出，置于37℃水浴锅中过夜温育，次日将染色的材料放于卡诺固定液中脱色，期间及时更换固定液，最后将脱色的材料放入培养皿中，通过实体显微镜观察GUS染色情况，并分析该启动子的组织表达特异性。

2 结果与分析

2.1 PagC3H3在84K杨不同组织表达分析

为了探究PagC3H3基因在84K杨不同组织中的表达特异性，分别提取同一植株的顶芽、顶部茎节、中部茎节、基部茎节、幼叶、功能叶、根等组织的Total RNA，利用qRT-PCR检测PagC3H3的基因的表达水平，同时以Ptractin基因作为内参，结果如图2所示，表明PagC3H3基因在不同组织中均有表达，且在根、中部茎节和基部茎节中表达量较高，在顶芽、顶部茎节、幼叶和功能叶中表达量较低，上述结果表明PagC3H3基因在木质化程度高的组织中高表达。

2.2 PagC3H3基因启动子序列克隆及分析

提取84K杨叶片DNA作为模板，根据设计的启动子引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测显示，条带大小与预期目标一致(图3A)，切胶回收连接pEASY-T1载体，转化大肠杆菌感受态(Trans1-T1)，对单克隆进行PCR检测(图3B)，将获得的阳性克隆命名为pEASY-PagC3H3-promoter，并送至擎科生物公司测序，测序结果表明上述目的片段是84K杨PagC3H3基因上游的启动子序列。利用PlantCARE在线软件对PagC3H3启动子的顺式作用元件进行预测分析，在上游启动子区域长2 035 bp(图4)范围内含有多种顺式作用元件，涉及多个生物学功能，具体包括以下几类(表1)：光响应元件、脱落酸响应元件、启动子和增强子作用元件、核心启动子元件、分生组织响应元件、厌氧诱导响应元件及MEJA反应响应元件。

图2 PagC3H3在84K杨不同组织表达分析Fig.2 Expression analysis of PagC3H3 in different tissues of P.alba×P.grandulos

图3 pEASY-PagC3H3-promoter载体的构建A.PagC3H3启动子的克隆：M. DNA marker DL5000；1. PagC3H3启动子的PCR扩增产物 B. pEASY-PagC3H3-promoter载体在大肠杆菌菌液中的PCR检测：M. DNA marker DL5000；1～3. pEASY-PagC3H3-promoter菌液PCR检测Fig.3 The construction of pEASY-PagC3H3-promoter vector A. The cloning of PagC3H3 promoter: M. DNA marker DL5000; 1. PCR amplification product of PagC3H3 promoter B. PCR detection of pEASY-PagC3H3-promoter vector in E.coli: M. DNA marker DL5000; 1-3. PCR detection of pEASY-PagC3H3-promoter vector

图4 84K杨PagC3H3启动子序列Fig.4 Sequence of the PagC3H3 promoter in P.alba×P.grandulos

图5 pBI121载体图谱Fig.5 pBI121 vector map

2.3 pBI121-PagC3H3pro::GUS载体构建

植物表达载体pBI121含有GUS融合蛋白系统，参照载体图谱(图5)，将PagC3H3启动子序列连接到pBI121上，构建表达载体pBI121-PagC3H3pro::GUS。利用HindⅢ和XbaⅠ这两种限制性内切酶分别对pBI121和pEASY-PagC3H3-promoter质粒进行双酶切，将目的片段进行切胶回收，通过DNA Ligation Kit连接并转化大肠杆菌感受态(Trans1-T1)，随机挑取单克隆进行PCR检测(图6A)，获得条带大小与目标一致的阳性克隆，将其菌液送至擎科生物公司测序。

选取测序正确的菌液进行质粒提取，转化农杆菌GV3101感受态，随机挑取单克隆进行PCR检测(图6B)， 结果显示单克隆均为阳性并命名为GV3101-pBI121-PagC3H3pro::GUS，该结果表明植物表达载体构建完成。

表1 PagC3H3启动子顺式作用元件列表

图6 pBI121-PagC3H3pro::GUS植物表达载体的构建 A. pBI121-PagC3H3pro::GUS载体在大肠杆菌菌液中的PCR检测：M. DNA marker DL5000；1～6.pBI121-PagC3H3pro::GUS菌液PCR检测；7.阴性对照 B. pBI121-PagC3H3pro::GUS载体在农杆菌(GV3101)菌液中的PCR检测：M. DNA marker DL5000；1-8. GV3101-pBI121-PagC3H3pro::GUS菌液PCR检测；9.阴性对照Fig.6 The construction of pBI121-PagC3H3pro::GUS plant expression vector A. PCR detection of pBI121-PagC3H3pro::GUS vector in E.coli; M. DNA marker DL5000; 1-6. PCR detection of pBI121-PagC3H3pro::GUS; 7. Negative control B. PCR detection of pBI121-PagC3H3pro::GUS vector in Agrobacterium tumefaciens(GV3101): M. DNA Marker DL5000; 1-8. PCR detection of GV3101-pBI121-PagC3H3pro::GUS; 9. Negative control

2.4 拟南芥瞬时转化及GUS活性检测

将两周龄的拟南芥幼苗浸泡在GV3101-pBI121-PagC3H3pro::GUS的农杆菌菌液中，进行瞬时转化，经GUS染色，脱色处理后，在实体显微镜下观察GUS活性，结果如图7所示，在下胚轴和根中GUS活性较强。推测84K杨PagC3H3启动子调控下游基因在木质化程度高的组织中强烈表达。

图7 PagC3H3启动子驱动GUS在拟南芥中的GUS染色Fig.7 GUS staining driven by the PagC3H3 promoter in Arabidopsis

3 讨论

木材是制浆造纸、房屋建造以及家具制作的重要原料，在社会生产中扮演着一个不可或缺的角色，因此培育出适合于林业相关产业加工与利用的优良林木品种是林木工作者的重要目标。木材的纤维素与木质素含量是影响木材加工与利用的重要因素，木质素作为植物体内仅次于纤维素的一类重要高分子化合物，不仅具有重要的生物学功能，还是一种重要的能源物质。如在造纸生产中，高木质素含量就是影响纸浆产量和纸张质量的不利因素之一，此外木材中的Guaiacyl型木质素(G-木质素)由于更难以加工会降低纸浆的产率[21]。

对Guaiacyl型木质素(G-木质素)、Syringyl型木质素(S-木质素)合成的关键基因C3H3的研究，有助于了解该基因在调节木材中3种木质素单体的含量、组成及结构等方面发挥的重要作用，有研究表明：当coumarate 3-hydroxylase(C3H)在杂交杨中被降低后，木质素含量降低，并且H型木质素增加以及S/G型木质素的比值上升[22]。

启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的位于基因上游的一段DNA序列。植物启动子通常包含TATA框、CAAT框和GC框，同时该区域还存在各种控制元件[23]，通过RNA聚合酶的识别、结合，诱导转录过程，从而在植物基因表达调控过程中起到重要作用[24～25]。启动子决定基因表达的时空特异性，可以为分析基因调控提供重要信息。由此通过研究启动子的特性，用于分析下游基因的表达特异性，有助于了解植物生长发育的过程及对外界环境的适应情况，从而能够更好的控制外源基因高效、稳定、长期的在目的部位表达。

本实验以广泛被应用的用材树种84K杨为研究对象，初步探究了84K杨PagC3H3基因的表达模式，对PagC3H3基因在84K杨不同组织中的特异性表达进行了分析，并对PagC3H3启动子进行了克隆及功能验证，证明了PagC3H3基因在木质化程度高的部位表达量高，也表明该启动子存在时空特异性表达的特征，由此推测该基因的表达模式为在木质化程度高的组织中高表达，暗示该基因在木质素合成过程中发挥作用。该研究对于PagC3H3基因功能的解析，涉及较少，例如该基因在调控木质素合成过程中是如何影响木材形成中的生长性状，如何利用该基因在木质素合成中发挥的作用来调节木质素的合成量及结构(木质素单体S/G比例)，从而对84K杨木材的工业化应用提供理论依据；其次，林木中C3H3启动子是如何准确调控C3H3基因在木质素合成中行使功能，还有待进一步的探究，期待在林木中对C3H3基因的功能做出更详细的阐述。