王玉梅 褚光辉 付玉（通讯作者）

（昆明理工大学医学院 云南 昆明 650000）

阿尔茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是一种最常见的神经退行性疾病，临床表现为进行性认知障碍和神经精神异常，AD的病理学改变包括：神经细胞内的神经元纤维缠结和细胞外的β淀粉样蛋白沉积等[1-2]。阿尔茨海默病的病因尚未完全明了，其发病机制的研究一直是神经科学研究的热点。目前，Aβ假说[3]因其能够较好的符合病理学、实验以及临床流行病学研究结果而受到越来越多的认可。

针对Aβ假说，目前构建了多种实验动物模型。APP/PSl双转基因小鼠被认为是最能够模拟AD自然病理生理过程的动物模型[4]。转基因鼠价格较高，为节约成本并使本课题有充足的AD模型，我们使用APP/PSl双转基因纯合子雄鼠和野生型雌鼠进行繁殖，采用Vazyme公司的试剂盒快速提取鼠尾基因组，采用多引物多重PCR进行子代小鼠基因型鉴定，鉴定结果准确快速。具体方法及结果如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

由南京模式动物研究所提供B6.Cg-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/Mmjax双转基因小鼠阳性雄鼠10只，野生阴性雌鼠10只（5～6月龄）。雌雄分开每5只一组饲养于昆明理工大学实验动物中心SPF级饲养间。饲养期间遵照国家实验动物饲养和使用指南，饲养环境为温度（22±2）℃ ，湿度：50%～70%，光周期L：D=12h：12h，自由饮水和取食。雄鼠体重28～32g，雌鼠体重23～26g。

1.2 主要试剂和仪器

One Step Mouse Genetyping Kit试剂盒（Vazyme公司）。APP、PSl引物（上海生工）。Genecolour Ⅱ TM核酸染料（北京金博益）。PCR仪（Biometra公司），凝胶电泳成像系统（Bio-Rad公司），低速台式离心机（Sigma公司），电泳仪（Bio-Rad公司）。

1.3 繁殖方法

实验动物购买后在实验室内饲养一月后进行实验。雄鼠与雌鼠一对一进行交配繁殖。子代小鼠出生28天后雌雄分笼饲养并打耳标进行标记。

1.4 基因鉴定

1.4.1 鼠尾获取 小鼠出生28天后剪取尾尖2～3mm备用。

1.4.2 DNA提取 （1）根据样品数按每个样品2μl蛋白酶K+100μl缓冲液配制裂解液；（2）每个EP管加入100μl裂解液确保鼠尾完全浸入，混匀，55℃金属浴20min；孵育完成后95℃金属浴5min灭活蛋白酶K；（3）裂解产物振荡混匀，12000rpm，离心5min。取上清液，-20℃保存。

1.4.3 PCR扩增引物序列设计如下 APP（350bp）正 义 链：5'-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3'； 反 义链：5'-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCC-3'。PSl（608bp）正 义 链：5'-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3'； 反 义 链：5'-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3'。GAPDH（224bp） 正义 链：5'- AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'， 反 义 链：5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3'。PCR反应体系25uL，同时加入三对引物进行扩增。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火40s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸7min。

PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳后进行光密度扫描，用凝胶成像分析系统进行观察分析。

2.结果

2.1 小鼠繁殖数量

初始繁殖笼10笼，淘汰无法生育，吃崽及不哺乳小鼠后剩余6笼为可繁殖笼。每笼平均约每月繁殖一窝，每次产仔4～6只。合笼3个月后子代小鼠存活状况及基因鉴定结果如表1所示。

表 合笼三个月后子代小鼠的总数及基因型

AD为APP/PSl双转基阳性鼠，WT为野生同窝阴性鼠。表中数据为合笼三个月后子代成活小鼠数量。

2.2 APP/PS1双转基因子代小鼠基因型的鉴定

以鼠尾组织基因组DNA为模板，鉴定电泳结果如图。5只小鼠的三引物体系均扩增出约200bp的内参基因，其中2、4、5号3只小鼠同时扩增出约350bp和600bp左右的条带，与APP和PS1基因大小相符。对比APP和PS1双引物体系的扩增结果，说明在合适的PCR条件下三引物体系可以准确有效鉴定出APP/PSl双转基因子代小鼠的基因型。

图 APP/PSl双转基因小鼠基因型的多引物PCR鉴定结果

M为DL2501 DNA Marker，2、4、5是双转基因阳性鼠，1、3是双转基因阴性鼠。

3.讨论

本实验采用APP/PSl双转基因纯合子雄鼠与野生同窝阴性雌鼠交配繁殖，根据遗传规律后代有1/4的机率为阴性纯合子，所以在使用前必须进行基因型检测。目前大多采用单引物进行基因扩增，鉴定过程较长且耗费较多的DNA样本及试剂。该实验使用Vazyme公司One Step Mouse Genetyping Kit试剂盒快速提取组织DNA，且裂解产物经离心后不需其他处理即可直接用做PCR扩增模板。采用多对引物法同时进行PCR扩增的鉴定结果与双引物法相同，但极大的节省了实验时间，为课题组今后开展AD相关研究提供了理想的动物模型。