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上海地区人群丙型肝炎病毒1b型进化树及其影响因素分析

2019-07-12

国际消化病杂志 2019年3期
关键词:上海地区进化树基因型

丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒科黄病毒属,为单正链RNA病毒[1]。HCV基因组全长9.6 kb,包含有5′ 非编码区(5′UTR)、3′UTR及一个编码约3 000个氨基酸的单一开放读码框(ORF)。HCV在宿主体内复制,每日能产生1 012个病毒[2]。由于HCV 非结构蛋白(NS)5B RdRp缺乏校错功能,HCV每复制一代可产生104~105个碱基突变[3-4]。因此,HCV在宿主体内以“准种”形式存在。准种内的病毒,其保守区同源性在91%~99%,变异部分主要为高变区-1(HVR-1)、HVR-2。目前HCV基因型可分为HCV1~7型,基因型之间的序列差异约为30%。每个基因型又可分为不同的基因亚型,基因亚型间的序列差异为15%~20%[5]。研究显示中国人群中HCV基因型主要为HCV 1b型(66%),其次为2a型(14%);但中国不同地区的HCV基因型分布存在差异,珠江三角洲地区HCV 6a型为第2大基因型[6]。目前中国HCV序列演变的规律及特征尚未明确,本研究通过扩增HCV 1b型NS3区序列,分析HCV 1b型序列变异情况、序列进化以及演变的规律,并进行人类白细胞抗原-A(HLA-A)及HLA-B类分子基因分型检测,分析上海地区人群的HLA-Ⅰ类分子遗传背景,明确上海地区人群的HLA-Ⅰ类分子对于HCV 1b型序列进化的影响。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2010年7月至2015年4月期间上海交通大学附属第一人民医院消化科及感染科诊治的89例慢性丙型肝炎患者,患者均为汉族,均对本研究知情同意。慢性丙型肝炎诊断标准参考2014年欧洲肝脏病协会(EASL)HCV感染诊治指南[7],选择HCV抗体阳性,HCV RNA阳性(HCV RNA定量检测结果在1.23 E+03~6.61 E+07 copies/mL)患者,排除近6个月内感染的患者。使用EDTA抗凝管采取全血标本。所有标本均排除人类免疫缺陷病毒(HIV)或乙型肝炎病毒(HBV)合并感染。

1.2 HCV RNA抽提及NS3区扩增

分离血清,抽提血清中HCV RNA(Qiagen病毒RNA抽提试剂盒),采用型别特异性引物扩增法对HCV RNA进行基因分型。采用巢式PCR对HCV 1b基因型的HCV NS3区进行扩增,反应体系及循环参数按照 TaKaRaTaq 聚合酶说明书。取10 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,于紫外光下成像,观察结果。将NS3区扩增阳性条带产物送至上海英俊生物技术有限公司测序。

1.3 HCV序列分析

测序结果使用 CodonCode Aligner 软件,参考序列峰图进行拼接后得到核苷酸序列。使用Align软件进行同源性分析。使用Ge-neious 7.0软件进行核苷酸及氨基酸序列分析。使用TreeMaker和FigTree软件,基因距离使用GTR方法,分析HCV NS3区的序列变异情况,并进行进化树分析。

1.4 HLA-A和HLA-B类分子测定

分离血细胞,进行基因组DNA抽提,采用型别特异性引物PCR法检测HCV 1b型患者相应的HLA-A及HLA-B类分子等位基因。分析人群HLA-A及HLA-B类分子基因频率,并与数据库中国人群HLA-A及HLA-B类分子基因频率比较。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料的比较采用独立样本t检验,组间HLA-A和HLA-B类分子频率比较采用卡方检验,HLA-Ⅰ类分子阳性及阴性患者中序列突变频率比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCV 1b型NS3区扩增

将PCR阳性结果送测序后,应用CodonCode Aligner软件,根据测序峰图进行序列拼接,最终得到89例HCV 1b型NS3区的全长核苷酸及氨基酸序列,序列经进化树分析后最终证实为1b型。

2.2 上海地区人群的HLA-A及HLA-B类分子基因分布情况

表1 HLA-A分子基因频率

表2 HLA-B分子基因频率

2.3 中国不同地区人群中HLA-A和HLA-B类分子基因频率比较

图1中国不同地区人群中HLA-A和HLA-B类分子基因频率比较AHLA-A类分子基因频率BHLA-B类分子基因频率

2.4 上海地区人群中HCV 1b型序列演变分析

将本研究扩增获得的89例HCV 1b型NS3区进行进化树分析,结果显示89例序列主要落于两个进化丛内,见图2。

图2 上海地区人群中HCV 1b型序列进化树分析

2.5 HCV NS3区序列进化丛形成的影响因素

表3 不同进化丛中HLA-A及HLA-B类分子基因频率比较

2.6 不同进化丛的一致序列比对结果

将进化丛1以及进化丛2序列分别进行序列比对,得到各自一致序列,再将不同进化丛一致序列与中国地区所有序列的一致序列以及HCV 1b型标准序列进行序列比对。结果显示进化丛1与中国所有序列的一致序列高度一致,同源性达100%,进化丛1的一致序列与HCV 1b型标准序列之间的同源性为96.67%,进化丛2的一致序列与标准序列之间的同源性为96.2%。本研究结果显示,HCV 1b型NS3区631个氨基酸中共有25个位点与标准序列不一致,其中14个位点位于已报道的T细胞表位内。

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