暴素青，曹艳丽

（1天津市第一中心医院内分泌科，天津 300192；2中国医科大学附属第一医院内分泌科，沈阳 110001）

近年来，由于生活方式、饮食结构改变，肥胖的患病率越来越高[1]。研究表明[2-6]，肥胖相关的胰岛素抵抗是一种慢性低度炎症性疾病，在胰腺组织中表现为巨噬细胞浸润增加，激活炎症信号通路，抑制胰岛素信号通路，随着胰岛β细胞破坏增多，最终出现高血糖状态[2-6]。在II型糖尿病中，促炎细胞因子介导β细胞功能紊乱是糖尿病的特征性改变，而影响β细胞功能的促炎因子包括c-反应蛋白、细胞因子（如IL-1β，IL-6，TNF-α等）及趋化因子（如单核细胞趋化因子1，IL-8等）[7]。这些促炎因子可通过NF-κB信号通路，影响胰岛素受体底物1与2磷酸化水平，使丝氨酸磷酸化增多，进而影响胰岛素信号传导[8]。

TLR4信号通路在肥胖个体胰腺β细胞功能紊乱中起着重要作用，其作为一种病原模式识别受体，能够识别脂类、脂蛋白及一系列内源性配体（如氧化性低密度脂蛋白等），可介导树突细胞、巨噬细胞、脂肪组织及胰腺组织中炎症因子的产生[9-12]。在高脂饮食者，血循环中游离脂肪酸（FFAs）升高，可激活TLR4/myd88信号通路，通过释放过量趋化因子，使胰岛中单核巨噬细胞浸润增多，最终促进β细胞功能紊乱的发生[13,14]。在II型糖尿病个体中，胰岛中巨噬细胞浸润增加可直接导致β细胞功能紊乱的发生[15]。

绿茶，作为一种传统饮品，其主要活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）（约占绿茶儿茶素60%），对肥胖、糖尿病、抗动脉粥样硬化等多种疾病均具有明显的药理作用[16,17]。在肥胖小鼠中，Dickinson等人报道EGCG通过清除体内过多自由基，恢复DNA修复蛋白水平，增加抗氧化酶活性，进而改善胰岛素信号传导及胰岛β细胞功能[18]。Hara等人报道，EGCG能改善离体胰岛细胞存活率，可能通过抑制8-羟基-2脱氧鸟苷的含量来实现[19]。也可抑制脂肪酶活性，抑制肥胖发生，同时可增强胰岛素受体底物2信号，改善胰岛素信号传导[20]。

EGCG是否可通过作用于TLR4信号通路，改善胰腺组织炎症状态尚未见报道。因此本研究以高脂饲料喂养建立肥胖大鼠动物模型，观察EGCG对胰腺组织TLR4炎症信号通路是否存在调节作用，并探讨相关机制。

材料与方法

1 主要试剂

小鼠单克隆抗体TLR4及CD68购自Abcam公司；山羊多克隆抗体TNF-α、IL-6及β-actin均购自Santa Cruz公司；兔抗山羊免疫球蛋白G（IgG）及兔抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）均购自北京中杉公司；全蛋白提取试剂盒购自凯基公司；RNA稳定剂（RNAlater）购于QIAGEN公司；Trizol, cDNA反转录试剂盒及SYBR Select Master Mix均购于Invitrogen公司；引物由TaKaRa （大连宝生物公司）设计并合成；免疫组织化学试剂盒购自迈新公司；胰岛素测定碘（I125）放免试剂盒购自北京原子高科公司；游离脂肪酸测定采用酶法；EGCG（纯度≥ 98%）购于Cayman公司。

2 肥胖大鼠模型建立与实验分组

SPF级健康4w龄雄性SD大鼠30只，体重85～108克，购自北京华阜康动物饲养公司。实验前适应性喂养1w后，随机分为正常饮食组（normal diet, NC，n=10）和高脂饮食组（high-fat diet，HFD，n=20）。大鼠饲养于中国医科大学动物饲养中心，每笼5只，温度控制在（22±2）℃，湿度控制在55%～60%，明暗交替周期为12h。所用饲料由实验动物中心提供。喂养期间自由摄食和摄水，每周固定时间称重，记录大鼠生长曲线。喂养16w后，普食组（NC）和高脂饮食组（HFD）大鼠体重出现明显差异，开始进入EGCG干预阶段。此实验的所有过程均按照国家卫生研究所实验动物使用规章进行。

肥胖模型建立后，将HFD组大鼠按照随机区组原则分为两组：单纯高脂饮食组（HFD，n=10）和含0.32% EGCG（相当于每200ml杯中含2g茶叶，共10杯）的高脂饮食组（HFD+EGCG，n=10），余喂养条件不变。每周监测大鼠体重及摄食量。干预16周。

3 标本采集及测定

大鼠禁食14h，称重，10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉，心尖取血，立即 4℃低温下3000r/min离心10min，分离血清置-80℃冰箱冻存备用。迅速取出胰腺组织，剔除血管及其他结缔组织。分两部分处理：①将组织切为长宽高均≤0.5cm，放于RNA稳定剂（RNA later）中，为下一步Real-time RT-PCR做准备；②另一部分置于冻存管后放入液氮中，过夜后移至-80℃冰箱中冻存备用。

4 生物化学分析

尾静脉采血罗氏血糖仪测定3组大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）；碘（I125）放免试剂盒测定基础胰岛素水平（fasting serum insulin，FINS），并计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-insulin resistance index ，HOMA-IR index）：HOMA-IR= FBG（mmol/l）×FINS（mU/l）/22.5；采用酶法测定血清中游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）水平。

5 免疫组织化学

选取适当大小的胰腺组织放于冰冻切片机（Leica CM3050 S）组织托上，用OCT包埋，切片厚度约6μm，粘片，于4°丙酮中固定10min，0.01 mol/L PBS 冲洗3次×5min, 3 % H2O2淬灭内源性过氧化物酶10min，PBS冲洗3次，加一抗（CD68：1:200；TNF-α：1:100）4℃过夜，PBS冲洗3次，血清封闭10min，相应种属生物素化的二抗室温孵育30min，PBS冲洗3次，加链霉素亲和素-过氧化物酶复合体室温孵育10min。PBS冲洗3次，DAB显色1min（镜下观察确定显色时间），苏木素复染，酒精脱水、苯化，中性树胶封片。显微镜下观察，利用Image-Pro Plus 5.0 软件进行IOD值分析。

6 巨噬细胞浸润评估

采用CD68免疫组织化学染色标记胰腺组织中巨噬细胞，每组随机选取10张不同的切片于显微镜下观察（×40高倍视野）、记数并统计分析。

7 Real-time RT-PCR检测胰腺中炎症因子表达水平

称取100mg胰腺组织，剪碎并充分匀浆，采用Trizol试剂（Invitrogen 公司）说明书抽提总RNA，应用 Tecan in finite M200 多功能酶标仪测定 RNA 纯度（纯度在1.8～2.0）及浓度，取RNA 200ng 进行逆转录（High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，Invitrogen 公司）。

目的基因和内参（GAPDH）的引物序列由 Takara公司设计并合成，序列见表1。按照SYBR@Select Master Mix试剂盒（Life technology公司）说明书，采用 Light Cycler 480荧光定量 PCR 仪进行实时定量PCR反应。反应体系 20μl，反应条件 50℃ 2min预变性，95℃ 2min变性，95℃ 15s，60℃ 1min，40循环。结果通过LightCycler480 1.5软件分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences used in real-time PCR analysis

8 Western blot检测胰腺中炎症因子蛋白水平

剪取约100mg胰腺组织依次加入适量的裂解液、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及PMSF（KGP 250 kit），匀浆（8min），匀浆后置于冰浴中30min，10000r/min离心30min，取管底清液，BCA法测定蛋白浓度，定量，加入等体的SDS-PAGE样品缓冲液，于100℃煮沸5min，放于-20℃保存备用。

待所有样品获得后加样进行SDS-PAGE蛋白电泳，其后转移至PVDF膜，用TBST洗膜（5min×3），用含5% BSA TBST缓冲液室温封闭1h，加一抗4℃过夜孵育，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1h，洗膜，用增强型化学发光法（ECL）显色，成像检测系统（Alphaview 1.3）成像， Image-pro Plus 6.0 (IPP 6.0) 图像处理软件定量分析，以目的蛋白条带光密度与内参蛋白（β-actin）条带光密度比值作为目的蛋白相对水平。

9 统计学处理

所有统计资料用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析。数据进行正态性检验后以±SD表示。组间差异比较采用单因素ANOVA方法分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 EGCG改善高脂饮食大鼠糖代谢异常

为了评估EGCG对机体代谢改变，我们检测了EGCG处理对大鼠体重、FFAs、FBG、FINS和HOMA-IR指数及摄食量的影响。结果显示，HFD组大鼠体重、FFAs、FINS和HOMA-IR指数均明显高于NC组；EGCG处理的HFD大鼠，体重、FFAs、FINS和HOMA-IR指数显著低于HFD大鼠，与NC大鼠相近；三组大鼠FBG水平无明显统计学差异（表2）。

表2 EGCG对大鼠代谢相关指标的影响Tab. 2 Effects of EGCG on metabolic related factors in rats

2 EGCG减轻高脂饮食大鼠胰岛中炎症状态

免疫组织化学检测显示：与NC组相比，HFD组胰岛中巨噬细胞浸润明显增多，而EGCG组巨噬细胞浸润较HFD组明显减少，略多于NC组，且与NC组比较无显著性差异（图1A，图1B）。 对CD68水平的Western blot分析发现，HFD大鼠胰腺CD68水平明显上调，而EGCG处理的HFD大鼠CD68水平明显低于HFD大鼠，约为HFD组64.5%，略高于NC组，与NC组比较无显著性差异（图1C）。

对胰腺TNF-α进行免疫组织化学和Western blot检测显示，HFD组TNF-α免疫反应性明显增强，约为NC组的4倍，而EGCG干预组的TNF-α免疫反应性明显低于HFD组，约为HFD组的40%（图2）。上述结果表明，EGCG能明显抑制胰岛炎症发生，降低炎症细胞因子TNF-α水平。

3 EGCG抑制高脂饮食大鼠胰腺TNF-α和IL-6表达的上调

为了进一步评估EGCG对炎症状态的作用，我们检测了胰腺中炎症相关因子TLR4、TRAF6、TNF-α及IL-6表达。高脂饮食大鼠胰腺中TLR4、TRAF6、TNF-α及IL-6 mRNA水平明显升高，分别约为对照组的1.4倍、1.3倍、2.2倍及4.5倍（图3）。EGCG处理的HDF大鼠胰腺中TNF-α mRNA及蛋白水平较HFD大鼠均明显下降，分别约为HFD组的59.5%（图3）及65.3%（图4）；EGCG处理的HDF大鼠胰腺中IL-6 mRNA及蛋白水平较HFD大鼠亦明显下降，分别为HFD组的20.5%（图3）及69.5%（图4）；而EGCG处理的HFD大鼠胰腺中TLR4和 TRAF6 mRNA及蛋白水平较HFD组未见明显下降 (图3，图4)。

讨 论

本研究中，我们探讨了EGCG对高脂饮食所致胰腺组织炎症状态的作用机制。 研究结果表明，EGCG干预能抑制高脂饮食大鼠胰岛中巨噬细胞浸润和胰腺组织中TNF-α及IL-6表达的上调，这种抑制炎症的作用并非通过降低TLR4信号通路活性来实现。

图1 EGCG对高脂饮食大鼠胰岛中巨噬细胞浸润和CD68水平的影响。A，CD68免疫组织化学染色标记巨噬细胞（箭头）,以苏木精复染核；比例尺，50μm；B，胰岛中每高倍视野中巨噬细胞浸润数量统计学分析；C1，胰腺CD68水平Western blot检测；C2，胰腺CD68水平统计学分析（正常组标化为 1）； **， P ＜ 0.01; *，0.01＜ P ＜ 0.05; n=9Fig. 1 Effect of EGCG on in filtration of macrophage and CD68 level in the pancreas islets of the rats with high-fat diet. A, macrophages were labelled by CD68 with immunohistochemical staining (arrows), nuclei were counterstained with hematoxylin; scale bar, 50μm; B, statistical analysis for the numbers of macrophages in filtrating into the pancreas islets per high power field; C1, Western blotting for the level of CD68 in the pancreas; C2, statistical analysis for the level of CD68 (the level of NC group was normalized as 1); **, P ＜ 0.01; *, 0.01＜ P ＜ 0.05; n=9

EGCG是绿茶中主要活性成分。作为一种抗氧化剂，其可受到某些环境因素如pH值、温度、自由基水平等影响[21]。大鼠口服摄入EGCG后，进行甲基化、醛糖酸化及硫酸盐化反应，其EGCG代谢产物以上述形式存在，其中酚羟基含量决定EGCG及其代谢产物抗菌、抗动脉硬化及抗肿瘤活性[22]。

近年来，越来越多的研究集中在EGCG与肥胖方面[23-25]。在本项研究中，EGCG对高脂饮食大鼠表现出一定的抑制体重增加作用，降低血清中FFAs水平，而摄食量并未见明显改变，这些与既往一些研究报道相一致[26-27]。而基础血糖水平三组之间未见明显统计学差异，此与既往报道不一致[28]，我们推测可能与饮食结构、种属（大鼠与小鼠）及摄取方式有关。EGCG干预可改善高脂大鼠HOMA-IR值，表明其可改善胰岛素敏感性，增加机体对外源性葡萄糖的代谢能力[29]。

在胰岛细胞中，由于循环中高水平的FFAs刺激炎症趋化因子（如单核细胞趋化蛋白-1，趋化因子配体-2及IL-8等）表达增多，进而募集巨噬细胞浸润增加，这些炎症状态可使胰岛β细胞功能紊乱[9,13,15]。EGCG能够逆转高糖环境中胰岛素的释放，抑制核因子-κB（NF-κB）活性，进而保护胰岛细胞免受炎症因子（IL-1β, TNF-α及IL-6等）所致的功能紊乱发生[30-32]。同时EGCG能升高循环中IL-10水平，改善葡萄糖耐量，降低糖化血红蛋白水平，进而延缓1型糖尿病的发生[33]。在本研究中，我们发现EGCG可减少高脂饮食所致肥胖大鼠胰岛中巨噬细胞浸润，抑制炎症因子如TNF-α及IL-6的表达，进一步提示EGCG减轻胰腺组织炎症的同时，能改善机体胰岛素敏感性。

TLR4作为一种重要的模式分子识别受体，能够识别多种病原相关分子，如脂多糖（LPS），多肽及类脂（尤其是饱和脂肪酸）等，激活代谢相关炎症反应的发生[34-36]。其主要通过激活TLR4/MyD88信号通路介导趋化因子的产生及增加巨噬细胞浸润程度[15]。FetA，一种肝源性的糖蛋白，可作为衔接蛋白协助FFAs激活TLR4[37]。本研究中，高脂饮食明显明显增加TLR4水平，这与既往研究报道相一致，而EGCG干预并没有明显抑制TLR4表达上调，此与既往研究报道不一致[38]。我们推测对TLR4信号通路作用可能存在剂量依赖性，或是EGCG可能通过作用于其它途径（如信号传导与转录活化子（STAT），过氧化物酶体增殖子活化受体(PPAR)，或核因子κB (NF-κB)等）改善胰腺组织炎症状态[39]。因此，EGCG对胰腺组织中TLR4信号通路的影响尚需进一步研究。

图2 EGCG对高脂饮食大鼠胰岛中TNF-α水平的影响。A-C，胰腺TNF-α免疫组织化学染色（比例尺，50μm）；A，NC组；B，HFD组；C，EGCG组；D，TNF-α免疫反应性统计学分析（正常组标化为1）；*，0.01＜P ＜ 0.05；n=9Fig. 2 Effect of EGCG on levels of TNF-α in the pancreas islets of the rats with high-fat diet. A to C, immunohistochemical staining of TNF-α in pancreas (scale bar, 50μm); A, NC group; B, HFD group; C, EGCG group; D, statistical analysis for the immunoreactivity of TNF-α (the level of NC group was normalized as 1); *, 0.01＜ P＜ 0.05; n=9

图3 EGCG对高脂饮食大鼠胰腺中TLR4、TRAF6、TNF-α及IL-6 mRNA表达影响的实时定量PCR检测。 *，0.01＜P ＜ 0.05 vs NC组；#，0.01＜P ＜ 0.05 vs HFD 组；n=9Fig. 3 Real-time quantitative PCR detection for effect of EGCG on mRNA expression of TLR4, TRAF6, TNF-α and IL-6 in the pancreas of the rats with high-fat diet. *, 0.01＜P ＜ 0.05 vs NC group; #, 0.01＜P ＜ 0.05 vs HFD group; n=9

图4 EGCG对高脂饮食大鼠胰腺中TLR4、TNF-α及IL-6表达影响的 Western blot检测。*，0.01＜P ＜ 0.05 vs NC 组；#，0.01＜P ＜ 0.05 vs HFD 组；n=9Fig. 4 Western blotting detection for effect of EGCG on protein expression of TLR4, TNF-α and IL-6 in the pancreas of the rats with high-fat diet. *, 0.01＜P ＜ 0.05 vs NC group; #, 0.01＜P ＜ 0.05 vs HFD group; n=9

这项研究尚存在一些局限性，如仅利用单一的EGCG剂量来探索其对胰腺组织中TLR4信号通路的影响，EGCG作用可能存在剂量依赖性。而EGCG喂养组大鼠血清中EGCG浓度未进行测定，EGCG生物利用度未知，这些均可能影响本研究结果。

综上，本研究表明EGCG可改善高脂大鼠胰腺组织中炎症状态，减轻胰岛中巨噬细胞浸润，阻止胰腺β细胞功能紊乱发生，增加胰岛素敏感性。这些结果为EGCG抗炎活性分子学机制提供了一个新视角，未来还需要进一步研究来探讨不同剂量的EGCG对胰岛β细胞的功能的作用。