许洪宝 张贵阳 郑照正 蔡炜龙 汪伟民 楼能

结直肠癌(colorectal cancer)是世界上第3大常见的恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的第4大原因[1]。K-RAS基因是目前结直肠癌研究领域中最受关注的基因之一，它对调控肿瘤细胞生长起着枢纽作用。K-RAS基因突变能够导致细胞生长失去调控，引起肿瘤细胞快速生长[2]。因此K-RAS基因是否有突变是影响肿瘤预后的一个重要指标。肿瘤浸润T细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）是直接从肿瘤组织中分离出来的淋巴细胞，它们能够识别肿瘤抗原，直接诱导肿瘤细胞溶解，或释放特定的趋化和促炎细胞因子[3]。TIL是否大量存在与结直肠癌患者的临床预后密切相关[4]。这两项指标与肿瘤的发生、发展和预后关系密切，近年已引起国内外学者的广泛关注。由于左半与右半结肠癌有不同的临床特征，其K-RAS基因和TIL表达情况如何，笔者作了进一步研究，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集本院2017年1月至2019年1月手术治疗的结直肠癌患者315例。根据病变部位分为两组，其中左半结肠癌175例，右半结癌（包括直肠癌）140例，两组患者在性别、年龄、淋巴转移状态、肿瘤分化程度、病理分期等方面的比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）,见表1。入选标准：（1）经病理检查确诊为结直肠癌；（2）未行化疗、放疗等其他抗肿瘤治疗；（3）本人或其家属签署知情同意书。排除标准：（1）合并有其他恶性肿瘤；（2）合并有严重心肺疾病；（3）合并有克罗恩病、溃疡性结肠炎等其他肠道疾病。本研究经本院伦理委员会批准。

表1 两组结肠癌患者一般资料比较[例（%）]

1.2 方法

1.2.1 K-RAS基因突变情况检测 采用二代测序技术，按照说明书步骤在组织标本中提取各组DNA，应用高通量基因测序仪检测结直肠癌K-RAS基因突变状态，依次构建文库、基因测序和数据分析。具体步骤如下：根据测序需要，将提取的DNA构建文库；根据扩增片段，加用测序接头，进行文库的扩增。然后应用测量仪检测DNA浓度。根据样本的测序需求混合样本，继续检测取得的混合样本中DNA的浓度，稀释制备模板。在测序完成后进行拼接、过滤，舍弃低质量序列及杂合序列，获得用于分析的优质序列，最后在基因测序仪上进行测序。

1.2.2 TIL（CD3＋、CD4＋T淋巴细胞）表达水平检测 （1）先通过固定、浸泡、脱蜡方式处理组织切片；（2）用PBS液冲洗3次以上，然后将切片置于加热后的柠檬酸缓冲液中；（3）约15min后取出切片，待冷却后再次用缓冲液冲洗；（4）切片加一抗处理，置于冰箱内以4℃保存约24h，取出后再次进行冲洗；（5）切片加二抗处理，室温下孵育约10min，再用缓冲液冲洗；（6）PBS液洗膜，DAB显色处理，显微镜观察染色结果。染色强度计分：无色为0分，浅黄色为1分,黄色为2分，深黄色为3分。阳性细胞百分比计分：≤5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分,51%～75%为3分，＞75%为4分。最终的结果为染色强度与阳性细胞百分比计分的乘积：＜3分为阴性（-），3～4 分为弱阳性（+），4～5分为中等阳性（++），＞6分为强阳性（+++）。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验，等级资料组间比较采用非参数秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组K-RAS基因突变情况比较 对左半结肠癌与右半结肠癌K-RAS基因突变情况检测结果进行分析，发现左半结肠癌K-RAS基因野生型比例高于右半结肠癌，差异有统计学意义（χ2=6.27，P＜0.05），见表 2。

表2 两组K-RAS基因突变情况的比较[例（%）]

2.2 两组TIL表达情况的比较 免疫组化染色法检测CD3+、CD4+T淋巴细胞阴性及阳性表达情况见图1。对左、右半结肠癌TIL表达情况进行分析，发现左半结肠癌CD3+、CD4+比例均高于右半结肠癌，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表 3。

图 1 免疫组化染色结果[a～c：阴性对照；d～i：阳性对照；d：CD3（+）；e：CD3（++）；f:CD3（+++）；g：CD4（+）；h：CD4（++）；i：CD4（+++）；免疫组化染色，×400]

2.3 两组肝、肺转移发生率的比较 对左半结肠癌与右半结肠癌肝、肺转移发生率进行比较，发现右半结肠癌肝、肺转移比例均高于左半结肠癌，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表 4。

表3 两组CD3+、CD4+表达情况的比较[例（%）]

表4 两组肝转移发生率的比较[例（%）]

3 讨论

结直肠癌早期诊断困难，许多患者就诊时已发生了远处转移，5年生存率低，是全球范围内发病率和病死率都极高的恶性肿瘤[5-7]。随着人们对结直肠癌信号通路与分子分型研究的深入，发现K-RAS通路对结直肠癌的发生、发展起重要作用[8]。国内外多项研究表明，K-RAS基因野生型控制着细胞生长路径的调控，K-RAS基因突变可能与结直肠癌病变部位有关，且通常右半结肠癌发病率高于左半结肠癌，但与其他临床病理特征无关[9-10]，本研究结果与此一致。K-RAS作为RAS基因中的一员，突变频繁，检出率可达40%，K-RAS基因突变会直接影响抗肿瘤药物的疗效，从而影响肿瘤患者的预后[11]。

在结直肠癌中，免疫反应和TIL分析已被作为肿瘤分类的手段和预后的生物学标志物。结直肠癌患者肿瘤组织中存在 TIL，大多数研究表明，CD3+、CD8+、PTPRC+或FOXP3+T淋巴细胞密度越高，临床疗效越好（能表现出较强的免疫应答）[12]。在Kwak等[13]的研究中，证实肿瘤组织中TIL不仅存在数量上的差异，而且与肿瘤部位关系密切，本研究结果也与此一致，即CD3+、CD4+T淋巴细胞比例左半结肠癌高于右半结肠癌。CD4+作为辅助T淋巴细胞的主要表面标志物，是免疫肿瘤细胞死亡的主要介质，介导肿瘤细胞的表达，对肿瘤进展起保护作用[14]。在一些强调CD4+细胞可能通过Th1机制介导抗肿瘤反应的研究中发现，在结直肠癌抗肿瘤免疫中CD4+T淋巴细胞发挥不可或缺的作用。近年来多项研究表明，CD4+T淋巴细胞不仅可以提高CD8+T淋巴细胞的疗效，而且还具有单独消除肿瘤细胞的作用。

左、右半结肠癌具有不同的生物学和临床特征，在Salem等[15]的研究中发现，与左半结肠癌相比，右半结肠癌具有频繁的EGFR通路异常活动和突变风险。一项关于结肠癌生存周期的研究表明，右半结肠癌的预后比左半结肠癌差[16]。Baldus等[17]研究表明，Kras基因突变的结直肠癌患者，出现远处器官转移的发生概率更高。Testa等[18]研究证实，结直肠癌转移与K-RAS基因突变和Tp53基因突变相关。

探讨左、右半结肠癌K-RAS基因及TIL表达情况，可以为结直肠癌患者疗效监测和预后评估提供临床检测指标，同时充分考虑左、右半结肠癌临床表现特征，为患者提供个体化诊疗方案，减少不必要的医疗费用。本研究从K-RAS基因突变类型和TIL表达水平层面探讨了左、右半结肠癌的差异，由于存在样本量相对较小、未进行多中心研究的不足，其最终结论有待于进一步扩大样本量，从多个医院采集病例，进行多中心研究来加以验证。