姚秀英 刘南南 王桂清

摘要：菌核生枝顶孢霉（Acremonium sclerotigenum）作为枝顶孢属真菌的优势种，其次生代谢产物多样。为了明确其对植物病害致病菌的抑制效果，以桃褐斑致病菌（Alternaria alternata）为靶标菌，采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定6种发酵液的抑菌活性。结果表明：PD培养基发酵液提取物对桃褐斑致病菌的抑制效果最好，对菌丝生长和孢子萌发的EC50分别为53.673 4 mg/L和808.158 4 mg/L;培养5 d的PD培养基发酵液的抑菌效果最好，对菌丝生长和孢子萌发的EC50分别为1.445 8 mg/L和309.631 8 mg/L;菌核生枝顶孢霉發酵液对桃褐斑致病菌菌丝生长的抑制效果优于对孢子萌发效果。该研究结果为将其开发成生物源农药奠定了理论基础。

关键词：菌核生枝顶孢霉;内生菌;次生代谢物，培养条件;抑菌活性

中图分类号：Q93    文献标识码：A    文章编号：1674-1161（2019）03-0018-05

随着人们对无污染、无公害绿色食品呼声日益提高，生物防治成为继农业防治、化学防治之后的又一种重要防治方法，许多生物杀菌剂相继问世，并广泛应用于生产，取得了显著效果。植物内生菌是微生物中非常重要的类群，其可以分泌抗生素、毒素等代谢物质，诱导植物产生系统抗性（ISR），将其次生代谢物制成药剂可起到生物防治作用，从而减少对生态环境的污染。植物内生菌为抗（抑）菌活性成分的筛选开辟了新的来源，在农业上具有非常广阔的应用前景。枝顶孢属真菌（Acremonium sp.）是一种世界性分布的丝状真菌，约有130余种，主要为腐生、植物寄生和自生，具有丰富的遗传和生态多样性，其次生代谢物多样（包括萜类、酚类、环肽、蒽醌类、生物碱类等），生物活性良好，是一类能够抑制多种植物病原真菌生长的拮抗真菌。本课题从国槐枝干中分离到一种枝顶孢属真菌，经形态、分子和致病性鉴定，最终确定为菌核生枝顶孢霉（A. sclerotigenum）。为了明确该内生菌的抑菌效果，以桃褐斑致病菌（Alternaria alternata）为靶标菌，采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定6种发酵液提取物的抑制活性，筛选出诱导菌核生枝顶孢霉有效次生代谢物产生的最适培养基和最适培养天数，为将其开发成生物源农药奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌种活化与培养

目标菌为菌核生枝顶孢霉，靶标菌为桃褐斑致病菌，均由聊城大学植物病理研究室提供，在PDA培养基、25±1 ℃条件下恒温培养5～10 d备用。

1.2 发酵液制备与提取

供试液体培养基包括：1） Fries培养基。蔗糖30.0 g，酒石酸铵5.0 g，KH2PO4 1.0 g，NH4NO3 1.0 g，MgSO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，结晶CaCl2 0.1 g，酵母膏1.0 g，蒸馏水1 000 mL。2） Czapek培养基。NaNO3 3.0 g，K2HPO4 1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4 0.01 g，蔗糖30.0 g，蒸馏水1 000 mL。3） 基础固体培养基。牛肉膏1.8 g，蛋白胨6.0 g，蒸馏水600 mL，磷酸氢二钾0.6 g。4） 改良沙氏培养基。葡萄糖12.0 g，蛋白胨6.0 g，蒸馏水600 mL。5） 酵母麦芽汁葡萄糖培养基（YMG）。葡萄糖4.0 g，麦芽提取物10.0 g，酵母提取物4.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 5.5±0.2。6） PD培养基。马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸馏水1 000 mL。

在装有300 mL不同液体培养基的锥形瓶（经高压灭菌）中接入直径为0.7 cm的菌核生枝顶孢霉菌片，每瓶45个。于25±1 ℃的恒温振荡培养箱中振荡培养7 d，经真空抽滤得到的滤液用旋转蒸发仪（温度60 ℃）浓缩，直至冷凝管中无溶液滴下，得到次生代谢物粗提物。对PD培养基进行3，5，7，9，11 d培养筛选，方法如上。

粗提物用三重水溶解，配制成20 000，10 000，

5 000，2 500，1 250 mg/L的浓度梯度，用于抑菌活性测定。

1.3 抑菌活性测定方法

1.3.1 生长速率法 采用生长速率法测定不同培养基发酵液提取物对菌丝生长的抑制效果。将备用各浓度提取液与PDA培养基以1∶9的比例制成系列含药培养基，使之终浓度为2 000，1 000，500，250，125 mg/L;接入直径0.7 cm的靶标菌菌饼，以加入等量无菌水的PDA培养基为对照，3次重复，于25±1 ℃，L∶D=

12∶12条件下恒温培养5 d，计算抑制率。

1.3.2 孢子萌发法 采用孢子萌发法测定发酵液提取物对孢子萌发的抑制效果。将备用各浓度提取液与靶标菌孢子悬浮液按体积比1∶5混合，使之终浓度为

3 333.3，1 666.7，833.3，416.7，208.3 mg/L;凹载玻片中加入混合液10 μL，于25±1 ℃下黑暗保湿培养24 h，3次重复，显微镜下观察孢子数及孢子萌发状况（至少观察100个孢子），计算孢子萌发抑制率。

1.4 数据处理

利用Excel软件进行数据统计整理，经DPSv7.05统计软件进行方差分析、差异显著性检验、相关系数、线性回归等。

2 结果与分析

2.1 不同培养基发酵液对桃褐斑致病菌的抑制作用

2.1.1 对菌丝生长的抑制效果 培养7 d的6种培养基发酵液提取物对桃褐斑致病菌菌丝生长的抑制效果如图1和表1所示。

由图1和表1可以看出：不同培养基发酵液对桃褐斑致病菌菌丝生长的抑制效果不同，且抑制效果均随着发酵液浓度提高呈现增长趋势，即抑制率与浓度呈线性正相关。其中，PD培养基发酵液对菌丝生长抑制效果最好，各浓度的抑菌效果均在55%以上，EC50为53.673 4 mg/L;Fries培养基、Czapek培养基、基础固体培养基、改良沙氏培养基、YMG培养基这5种培养基发酵液的抑菌效果一般，抑制率均在26%以下，EC50均超过30 000.000 0 mg/L。

2.1.2 对孢子萌发的抑制效果 6种培养基发酵液提取物对桃褐斑致病菌孢子萌发的抑制效果如图2和表2所示。

由图2和表2可以看出：不同培养基发酵液提取物对桃褐斑致病菌孢子萌发的抑制效果趋势与对菌丝生长的抑制效果趋势相同。虽然PD培养基发酵液提取物对孢子萌发的抑制效果最好，但不及对菌丝生长的抑制效果，各浓度的抑制率均在25%以上，EC50为808.158 4 mg/L，是菌丝生长EC50的15.06倍，说明其对菌丝生长的抑制效果是孢子萌发的15.06倍;其他5种培养基发酵液的抑制率均在30%以下，EC50在30 000.000 0 mg/L～170 000.000 0 mg/L之间，抑制效果较差。

综合对菌丝生长和孢子萌发的抑制效果，说明PD培养基是诱导菌核生枝顶孢霉产生抑制桃褐斑致病菌效果最好的次生代谢物的最适培养基。

2.2 PD培养基不同培养时间发酵液提取物对桃褐斑致病菌的抑制作用

2.2.1 对菌丝生长的抑制效果 分别培养3，5，7，9，11 d的PD培养基发酵液提取物对桃褐斑病菌菌丝的抑制效果如图3和表3所示。

由图3和表3可以看出：不同培养时间的发酵液对桃褐斑致病菌菌丝生长的抑制效果不同，且抑制效果均随着发酵液浓度提高而增长，即抑制率与浓度呈线性正相关。其中，培养5 d的发酵液对菌丝生长的抑制效果最好，各浓度的抑制效果均在83%以上，EC50为1.445 8 mg/L;3，7，9，11 d的抑制效果均不及5 d的抑制效果，EC50均超过6.000 0 mg/L。

2.2.2 对孢子萌发的抑制效果 不同培养时间的发酵液提取物对桃褐斑致病菌孢子萌发的抑制效果如图4和表4所示。

由图4和表4可以看出：除208.3 mg/L和416.7 mg/L处略低于11 d外，培养5 d的发酵液对桃褐斑致病菌孢子萌发的抑制效果总体高于其他4个时间。虽然5 d的发酵液提取物抑制效果最好，但不及对菌丝生长的效果，各浓度的抑制率均在30%以上，EC50为309.631 8 mg/L，为菌丝生长EC50的214.16倍，说明其对菌丝生长的抑制效果是孢子萌发的214.16倍;其他4个时间发酵液的EC50在315.000 0～

1 500.000 0 mg/L之间，抑制效果较差。

3 结论与讨论

为了明确菌核生枝顶孢霉（Acremonium sclerotigenum）对植物病害致病菌的抑制效果，采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定其6种培养基发酵液对桃褐斑致病菌的抑菌活性，并进行培养时间筛选。结果表明：PD培养基发酵液提取物活性最强，培养5 d的抑菌效果最好。

从营养角度分析，培养基中普遍含有水分、碳源、氮源、无机盐类和生长素，营养条件合适与否直接影响真菌的产毒及产生毒素的量，即影响真菌代谢产物的抑菌效果。PD培养基中的马铃薯浸出液含有碳源、氮源、生长物质、矿物质等多种微生物生长所需物质，有助于各种霉菌生长，而Fries缺少氮源、Czapek缺少氮源和生长物质、改良沙氏缺少矿物质、YMG缺少氮源和矿物质、基础固体培养基缺少碳源物质，与PD培养基相比营养不全面。

枝顶孢属不同菌种在不同培养基中培养得到的发酵物对不同病原菌的抑菌活性不同。姚磊等人利用琼脂平板扩散法测定枝顶孢属真菌SC0105在小麦与YMG混合培养基中发酵不同天数的发酵物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌活性，结果表明，SC0105在小麦与YMG混合培养基中发酵16 d的发酵物抑菌活性最强。而本课题研究表明，菌核生枝顶孢霉（Acremonium sclerotigenum）在PD培养基中发酵5 d的发酵物对桃褐斑致病菌（Alternaria alternata）的抑菌活性最强。

对植物内生真菌的生物防治已有大量研究，结果表明，从植物内生真菌中可发现新颖且具有抗菌活性的次生代谢产物，其中某些化合物的活性较强，具有开发成为新一类抗菌药物的潜力。菌核生枝顶孢霉作为一种内生菌，其次生代谢产物的相关研究尚少，本课题筛选诱导其对桃褐斑致病菌产生生物活性物质的发酵培养基和诱导时长，明确培养5 d的PD培养基为最适发酵条件，为将其开发成生物源农药奠定了理论基础。关于菌核生枝顶孢霉的杀菌抑菌谱和作用机理等均有待于进一步探索。

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