陈圣菊，尚画雨，白胜超，张 荷，张俊芬，邱平学，周 越

相关报告显示，当前全球有2亿肥胖患者，而中国肥胖人口已达6 200万，居全球第二，增速为全球之最[1]。肥胖个体通常伴有脂肪组织的炎性介质分泌增加和局部缺氧[2]。随着肥胖的发展，脂肪细胞体积变大(主要集中于腹部和睾周)，功能紊乱，出现胰岛素抵抗(insulin rsistance，IR)等多种病理特征[3]。其中由脂肪组织分泌的炎症因子导致的慢性炎症是肥胖和胰岛素抵抗的关键连接机制，这种慢性炎症反应是IR发生的重要因素，但目前肥胖引起IR形成的具体分子机制尚未明确。缺氧是脂肪组织功能紊乱的一个重要原因。低氧诱导因子 -1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的激活是低氧应答的主要机制，其α亚基对氧比较敏感，通过转移到细胞核内与β亚基结合进而激活其靶基因[4]，影响红细胞的生成、炎症及糖代谢，是机体缺氧反应的重要标志物，被称为“缺氧基因表达的总开关”。葡萄糖转运蛋白-1(glucose transporter 1，Glut-1)是最早发现并且在人体内分布最为广泛的转运体，是HIF-1α的下游调控因子，二者在低氧反应中起着关键作用，被视为维持机体内氧平衡的主要调节因子[5]。

前期研究表明，机体缺氧与胰岛素敏感性降低有关，但其具体作用及分子机制尚未阐明。关于胰腺β细胞功能的研究表明，常氧运动可在一定程度上改善胰腺β细胞功能，而慢性间歇低氧可能通过氧化应激损害胰腺β细胞的功能，β细胞凋亡增加，进而导致IR[6]。但Kolesnyk等[7]观察到，在糖尿病动物中，间歇性低氧训练干预可抑制其胰岛的破坏，有助于形成新的腺泡，从而保护β细胞的功能。低氧暴露能否加剧脂肪组织的缺氧状况?在低氧和运动的双重影响下HIF-1α和Glut1的表达如何变化?低氧、运动及低氧复合运动均可以改善饮食诱导的肥胖大鼠血脂代谢，低氧复合运动能够更好地改善血脂代谢[8]，可能是低氧与运动共同改善了IR。因此，本研究以肾周和睾周脂肪组织为切入点，观察IR大鼠脂肪组织重量、形态学及蛋白表达的变化，探究低氧运动对脂肪组织缺氧状况的影响，为运动治疗肥胖和IR提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

5周龄健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，购于北京维通利华实验动物有限公司，许可证编号：SCXK(京)2012-0001，体重140 g～160 g。 大鼠饲养及训练均于北京体育大学实验动物中心进行，且已通过北京体育大学运动科学实验伦理委员会批准。大鼠分笼饲养，每笼4只，自由饮水，室温(21±2)℃，相对湿度50% ±10%，昼夜照明，室内通风良好，隔天称重。

1.2 实验分组及干预方案

将大鼠随机分为对照组(C，n=8)和高脂组(HFD，n=40)，C组每天均给予足够的普通饲料喂养，建模组大鼠给予高脂膳食，高脂饲料(research diets，D12492)购于北京博奥派克生物科技有限公司，热量为5.24 kcal/g(脂肪60%，碳水化合物20%，蛋白质20%)。高脂膳食8周后，取HFD组和C组各8只，禁食12 h，对其行腹腔注射葡萄糖耐量 试 验 (intraperitonealglucose tolerance test，IPGTT)。腹腔注射50%浓度的葡萄糖，注射剂量按照每公斤体重2 g计算。分别于注射后0、30、60、120 min尾静脉采血，血糖仪测定血糖浓度，根据文献[9-10]计算曲线下面积(AUCBG)。具体操作方法和筛选标准成果已发表[8]。

将建模成功的大鼠(n=24)随机分为常氧安静组(NC，n=6)、常氧运动组(NE，n=6)、低氧安静组(HC，n=6)和低氧运动组(HE，n=6)，普通饲料喂养，正式实验前称重，各组大鼠体重无显著性差异。HC组和HE组进行低氧干预，NE组和HE组进行运动干预。低氧模拟海拔3 500 m高度，氧浓度约为13.7%，适应性训练1周后进行为期4周的跑台运动，大鼠体重及运动方案见表1。

表1 大鼠低氧训练实验安排Table 1 Rats hypoxia training experimental arrangement

1.3 样本采集

4周干预结束后行IPGTT试验，计算IR指数(HOMA-IR)及胰岛素敏感性指数(ISI)。腹腔麻醉取材，称量各组大鼠体重及肾周和睾周脂肪组织重量，称重后另取睾周脂肪少许，OCT包埋后投入液氮速冻，之后转移至-80℃冰箱保存，用于后期制作冰冻切片；取肾周脂肪装入冻存管中，投入液氮速冻，之后转移至-80℃冰箱保存，待测。

1.4 主要仪器与试剂

电子精密天平(JA1003)，上海天平仪器厂；冰冻切片机(LEICAUC6i)，德国；奥林巴斯(OlympusⅨ71)倒置显微镜图像采集系统，日本；垂直板蛋白电泳槽、电转槽及电泳仪，Bio-RAD公司，美国；凝胶成像(Chemi Doc TMXRS)，Bio-RAD 公司，美国；酶标仪(xMarkTMMicroplate Spectrophotometer)，Bio-RAD公司。

BCA蛋白定量试剂盒，货号-23225，Pierce公司；发光液，货号-34080MN Super Signal West Pico；化学发光底物Thermo SCIENTIFIC；PVDF膜，Millipore公司；预染蛋白 Marker，货号 -P7708，NEW ENGLANG BioLabs；HIF-1α 抗体，货号 -ab2185，abcam公司；Glut-1抗体，货号 -ab652，abcam 公司；小鼠抗GAPDH单抗，货号-TA-08，北京中山金桥生物技术有限公司；HRP标记山羊抗兔IgG，货号-ZB-2301，北京中山金桥生物技术有限公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG，货号-ZB-2305，北京中山金桥生物技术有限公司。

1.5 测试指标与方法

1.5.1 脂肪组织HE染色

冰冻切片机上调节温度为-30℃，将样品厚度调为12 μm，4%多聚甲醛固定后行HE染色，甘油封片。具体操作步骤按试剂盒说明书进行，每个样本连续切10张切片，处理完毕后于切片的中心视野处采集图像，采用Image Pro Plus 6.0软件处理图像。

1.5.2 Western Blot方法检测脂肪组织中HIF-1α和Glut-1蛋白表达

电子天平称量脂肪组织的质量，按一定比例加入裂解液，匀浆并离心，取上清液于4℃冰箱暂存。BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，具体操作方法按照试剂盒说明进行。加入上样缓冲液，充分混匀后100℃加热10 min，备用。按一定比例配制SDS-PAGE凝胶进行电泳，而后进行转膜，将蛋白转移到PVDF膜上。5%BSA封闭2 h后进行一抗杂交(HIF-1α1：500，Glut-1 1：500，GAPDH 1：2000)，利用Gel-pro软件进行条带灰度值统计分析。

1.6 统计学处理

采用SPSS19.0统计软件分析，实验数据均以平均数±标准差(¯x±s)表示。组内比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐性时用Bonferroni方法进行组间多重比较，方差不齐时采用Tamhanes'方法；采用多因素单变量方差分析对低氧和运动进行二者交互作用和主体间效应分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 低氧运动对IR大鼠体重的影响

如图1所示，4周低氧运动后，NE、HC和HE组较NC组体重显著下降(P＜0.05)，且体重增长率也低于NC组大鼠；与NE组相比，HC和HE组体重显著增加(P＜0.05)，体重增长率也高于NE组；与HC组相比，HE组体重显著下降(P＜0.05)。

多因素单变量方差分析结果显示，低氧和运动都对大鼠体重具有显著影响(P＜0.05)，2者具有交互作用(P＜0.05)。

2.2 各组大鼠脂肪细胞直径的变化情况

如图2所示，对各组大鼠睾周脂肪细胞行HE染色实验，显微镜下可见脂肪细胞NC组体积较大且大小不等，细胞充盈，有较大脂滴，交界处可见融合，有合成大细胞的趋势，有较多的炎性细胞浸润；其余3组细胞体积明显减小，大小均一且细胞边界明显，炎性细胞浸润减少。

图1 低氧运动4周后,各组大鼠体重变化统计结果Figure 1 The results of weight changes of rats in each group after 4-week hypoxic exercise

统计结果显示(图3a、3b)，经过4周的低氧运动，各组大鼠的内脏脂肪含量较NC组显著减少(P＜0.05)，且脂肪体重比也明显下降(P＜0.05)；与NE组相比，HC组大鼠内脏脂肪含量和脂肪体重比显著升高(P＜0.05)，HE与NE组无显著性差异，但HE组较HC组的内脏脂肪含量和脂肪体重比显著降低(P＜0.05)。

图2 低氧运动4周后,10×20倍光镜下各组大鼠脂肪组织HE染色结果Figure 2 HE staining results of adipose tissue of rats in each group under 10×20 light microscope

对HE染色结果进行统计(图3c)，结果显示，与NC组相比，NE、HC、HE 3组的细胞直径显著性减小(P＜0.05)且3组间脂肪细胞直径无明显差异。

多因素单变量方差分析结果显示，低氧和运动均对脂肪重量、体脂比及脂肪直径的变化具有显著性影响(P＜0.05)，2者具有交互作用(P＜0.05)。

图3 四周低氧运动后,各组大鼠内脏脂肪重量、体脂比及脂肪细胞直径统计结果Figure 3 The results of VW,VW/BW and Diameter in each group

2.3 低氧运动对脂肪组织HIF-1α和Glut-1表达的影响

统计结果显示(图4)，经过4周的低氧运动，其余三组的HIF-1α的蛋白表达水平较NC组明显降低，具有显著性差异(P＜0.05)；与NE组相比，HC组显著升高(P＜0.05)，HE组也略有升高但无统计学意义(P＞0.05)；HE组较HC组略有降低但无显著差异(P＞0.05)。

图4 四周低氧运动后,各组大鼠HIF-1α和Glut-1的蛋白表达的变化Figure 4 Changes of the expression of HIF-1α and Glut-1 protein

与NC组相比，NE、HC、HE组Glut-1的蛋白表达均无明显变化，但HE组较HC组Glut-1的蛋白表达显著降低(P＜0.05)。

多因素单变量方差分析结果显示，低氧和运动都对HIF-1α表达有显著性影响(P＜0.05)，2者具有交互作用(P＜0.05)；低氧和运动对Glut-1表达不具有显著性影响(P＞0.05)。

3 讨论

3.1 低氧运动对体重及脂肪组织的影响

本研究选用60%来自脂肪的高脂膳食喂养5周龄雄性SD大鼠，利用一系列动态观察有效地展现了经过4周低氧运动后，IR大鼠的体重、脂肪重量、睾周脂肪细胞直径以及蛋白表达的变化，为排除个体差异，计算脂肪重量与体重比。结果发现，与NC组相比，其余3组的体重都明显降低且体重增长也低于NC组，4组的体重增长量分别是初始体重的2.7、1.7、2.4和2.1倍。单独低氧较对照组体重也明显下降，可能是低氧提高了机体安静状态的代谢率，使脂肪细胞代谢增强从而减少了脂肪重量。低氧、运动及低氧复合运动都能使体重降低，且单纯运动和低氧复合运动效果较好。

本研究团队前期研究结果表明，4周低氧运动干预后，各组大鼠胰岛素敏感性均有所改善，但低氧对胰岛素敏感性的改善不如运动显著，可能是因为运动能更好的促进葡萄糖转运蛋白(Glucose Transporter)4向细胞膜转运，增强了摄取葡萄糖的能力[8]。

伴随着IR的系统性低度慢性炎症状态的发展，脂肪组织促炎因子分泌增多，而抗炎因子分泌减少，导致炎症失衡，大量免疫细胞如巨噬细胞、肥大细胞和B淋巴细胞等向脂肪组织聚集，炎性平衡遭到破坏，形成恶性循环[11]。随着肥胖的进一步发展，脂肪组织以数量增多和体积增大为明显变化，其中体积增大为主要特征。增大的脂肪细胞和氧气供应比例失衡，导致脂肪组织的局部缺氧，HIF-1α和Glut-1蛋白水平增加[12]。研究发现，特异性敲除小鼠脂肪细胞HIF-1α会导致肥胖相关炎症变化和胰岛素抵抗[13]。除受低氧刺激外，HIF-1α转录也受其他因素的影响，而在脂肪组织中，HIF-1α与肥胖诱导的炎症和胰岛素抵抗有关[13]。

Kitade等[14]对 C57BL/6J以及 Ccr5-/-小鼠进行16周的高脂饮食发现，肥胖能够通过Ccr5诱导脂肪组织招募巨噬细胞，使M1/M2分型发生改变。本研究通过对各组大鼠睾周脂肪细胞行HE染色，结果发现NC组存在明显的巨噬细胞浸润现象，细胞比较饱满，体积较大且有融合成大细胞的趋势，而4周的低氧运动可以减少巨噬细胞的浸润，减小细胞体积，这种变化在HE组更为明显。提示，低氧运动主要通过减小脂肪细胞的体积使内脏脂肪重量下降，进而降低脂肪体重比从而达到体重下降的效果。此外，通过HE染色也观察到低氧复合运动的运动方式对巨噬细胞浸润的改善优于单纯运动或低氧。

3.2 低氧运动对脂肪组织缺氧的影响

HIF-1包含α和β亚基，常氧条件下二者稳定存在于各组织中，而在低氧和热应力环境下，观察到鲍鱼腮部和血细胞中的HIF-1α含量明显升高而HIF-1β表达相对稳定[15]。Glut-1是一种广泛分布于人体细胞膜上的一种转运体，主要功能是维持基础状态下组织细胞葡萄糖的摄取，对糖代谢起着重要的调节作用。但目前对Glut-1的研究主要集中在缺血、缺氧条件下的HIF-1α与Glut-1的变化。活化的HIF-1α使Glut-1表达过量，使葡萄糖摄取增加，有助于增加机体组织对缺血、缺氧等特殊环境的耐受性[16]。最近研究表明，低氧环境能够显著增加HIF-1α的表达，促进脂肪干细胞对葡萄糖的摄取，提高Glut-1和Glut-3的表达[17]，表明HIF-1α和Glut-1在能量代谢中起着重要作用。

本研究结果显示，不管是常氧还是低氧，运动后脂肪组织HIF-1α蛋白表达明显降低，这表明运动使IR的大鼠脂肪组织缺氧情况得到了显著改善。并且，进行单纯低氧干预也能明显降低HIF-1α的蛋白表达，说明机体虽然处于低氧环境，但在此低氧条件下却能够显著缓解因IR造成的缺氧状态，可能是因为低氧提高了机体安静状态的代谢率，使脂肪细胞直径减小，缓解了缺氧状态，这也与黄徐根等[18]研究的结果一致。本实验结果显示，4周低氧运动干预后Glut-1的蛋白表达有下降的趋势，且在低氧复合运动后表达显著降低，表明在本实验条件下，低氧运动对IR大鼠脂肪组织的葡萄糖代谢影响不明显。考虑到Glut-1是HIF-1α的下游调控因子，这也与HIF-1α的表达一致，即低氧环境能刺激Glut-1的表达进而促进葡萄糖的摄取。之前实验结果显示4周的低氧运动干预能明显改善IR大鼠对胰岛素的敏感性从而促进葡萄糖转运，但本实验中Glut-1的表达并无显著变化，这可能是由于低氧运动提高了Glut-1摄取葡萄糖的效率，使Glut-1表达量并无显著增加因而导致本实验结果。此外，由于Glut-1广泛分布于机体各组织器官，通常与其他葡萄糖转运体亚型共同承担细胞的葡萄糖转运[19]，另外一种可能是在本实验中，Glut-1并不是主要改善IR大鼠对葡萄糖摄取的转运蛋白。杨贵明等[20]对高脂饮食诱导IR大鼠进行4周的间歇性低氧暴露，发现间歇低氧结合运动能够显著改善IR大鼠的抗氧化能力，而运动可通过激活线粒体自噬进而改善机体能量代谢，缓解IR[21]。结合本实验的研究结果，间歇低氧暴露改善大鼠的IR程度可能是由于改善了机体的抗氧化能力，增强了线粒体功能，清除了受损的线粒体，激活自噬，进而改善了IR程度。

间歇低氧运动可以通过刺激机体其他部位对糖的摄取、增强线粒体的功能进而提高了机体的有氧代谢，使IR大鼠体重下降，增强了胰岛素敏感性，改善了IR程度。因此，为进一步阐明低氧与运动干预对IR的作用机制，一方面可从骨骼肌线粒体着手，观察线粒体的生物合成和功能变化；另一方面可从脂肪组织的巨噬细胞入手，观察两种因素的干预对脂肪组织巨噬细胞分型和炎症的影响，从而为运动改善IR提供理论依据。

4 结论

运动能够有效降低IR大鼠的体重增长幅度，尤其是低氧运动能使大鼠体脂成分显著下降。

低氧暴露并未加剧IR大鼠脂肪组织的缺氧状况，反而能使体重降低，对脂肪组织的缺氧有改善作用。

常氧和低氧运动都能够通过减小脂肪细胞直径改善其缺氧状况，但并未对脂肪组织Glut-1的表达产生影响。