李 晨，叶 琳，李 羿，温荣城，陈宇航

成都医学院 药学院(成都 610500)

天麻为兰科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥块茎，始载于《神农本草经》，是我国传统珍贵中药材[1]。天麻有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效，适用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、惊痫抽搐等证。天麻主要含天麻素及其苷元、天麻多糖、生物碱、有机酸、香草醇等，天麻主要活性成分为天麻素[2]。研究[3-4]报道，天麻素有抗惊厥和神经保护等作用。本研究用醇提法从天麻中提取分离天麻素，通过单因素法和正交试验法考察和优化最佳提取工艺参数，旨在为天麻资源的科学开发和合理利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Angilent1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；UPH-II-10T 优谱系列超纯水器，四川优谱超纯科技有限公司；静音无油空压机 FX900-30，上海菲克苏工具有限公司；FA1204电子天平，上海皓庄仪器有限公司；DK-98-IIA电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；SHZ-DIII 循环水真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司。

天麻素标准品(批号：MUST-18030827，质量分数99.00%)，成都曼思特生物科技有限公司；磷酸(分析纯)、乙腈(色谱纯)，成都金山化学试剂有限公司；95%乙醇，成都市科隆化学品有限公司。

实验药材购于成都新都区长春大药房，经成都医学院李羿教授鉴定为兰科植物天麻Gastrodia.elataBl.的干燥块茎。将药材粉碎过2号药典筛[5]，备用。

1.2 天麻素提取

称取天麻药材粉末5 g，置于100 mL烧杯中，加入55%乙醇30 mL，用保鲜膜封住烧杯口。有研究[6]报道，温度对天麻素提取率影响较小,故选择适当的温度50 ℃水浴提取60 min[7]，连续提取2次。减压抽滤，合并滤液备用。

1.3 天麻素含量测定

1.3.1 标准品母液配制 精密称取干燥至恒重的天麻素标准品5.0 mg，加适量流动相溶液溶解，置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，得到浓度500 μg/mL的标准品母液。

1.3.2 供试品溶液制备 精密移取醇提滤液1 mL，置10 mL离心管中，氮吹1.5 h，残渣加1 mL流动相溶解完全，置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，用0.45 μm滤膜滤过，即得。

1.3.3 色谱条件[8]色谱柱:Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相:乙腈-0.05%磷酸水溶液(5∶95)；检测波长221 nm；流速1 mL/min；进样量20 μL；柱温25 ℃。

1.3.4 天麻素标准曲线制作 按0.125、0.25、0.5、1、2、4 mL的体积梯度，精密移取上述标准品母液，分别置于10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，使浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL。色谱条件按1.3.3项操作，进行含量测定，记录峰面积。以标准品溶液浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。

1.3.5 稳定性 称取样品1份，天麻素的醇提按1.2项操作，待测品溶液制备按1.3.2项操作，色谱条件按1.3.3项操作。在室温条件下分别放置0、2、4、6、8、10、12 h后，进样测定天麻素峰面积并计算其RSD值。

1.3.6 精密度 精密移取1 mL同一标准品溶液(200 μg/mL)，重复进样6次，色谱条件按1.3.3项操作，记录天麻素峰面积，计算其浓度和RSD值。

1.3.7 重复性 称取6份同一批样品，天麻素的醇提按1.2项下操作，待测品溶液制备按1.3.2项操作，色谱条件按1.3.3项操作，测定天麻素峰面积并计算其RSD值。

1.3.8 加标回收率考察 精密称取5份已知含量的天麻样品粉末，分别精密加入天麻素对照品适量，天麻素的醇提按1.2项操作，待测品溶液的制备按1.3.2项操作，色谱条件按1.3.3项操作，测定天麻素峰面积，计算回收率和RSD值。

1.3.9 天麻素提取率计算 移取适量供试品溶液，进行含量测定，计算样品中天麻素提取率=D×C×V/W×100%(C:天麻素浓度μg/mL；D:稀释倍数；V:供试品溶液体积 mL；W:原料质量μg)。

1.4 单因素试验初筛影响因素[9-11]

将料液比、乙醇体积分数、醇提时间和醇提次数作为4个考察因素。

1.4.1 乙醇体积分数对天麻素提取率的影响 精密称取5 g天麻粉末7份。料液比1∶10，醇提温度50 ℃，醇提时间60 min，醇提次数2次；再选取55%、60%、65%、70%、75%、80%、85% 7个乙醇提取体积分数。分别按1.2项、1.3项提取天麻素和测定含量，计算天麻素的提取率。

1.4.2 料液比对天麻素提取率的影响 精密称取5 g天麻粉末6份。醇提温度50 ℃，醇提时间60 min，乙醇体积分数55%，醇提次数2次；再选取1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18 7个料液比。分别按1.2项、1.3项提取天麻素和测定含量，计算天麻素的提取率。

1.4.3 醇提时间对天麻素提取率的影响 精密称取5 g天麻粉末4份。料液比1∶10，醇提温度50 ℃，醇提次数2次；再选取0.5、1、1.5、2 h 4个醇提时间。分别按1.2项、1.3项提取天麻素和测定含量，计算天麻素的提取率。

1.4.4 醇提次数对天麻素提取率的影响 精密称取5 g天麻粉末4份。料液比1∶10，醇提温度50 ℃，醇提时间60 min，乙醇体积分数55%，再选取2、3、4、5次4个醇提次数。分别按1.2项、1.3项提取天麻素和测定含量，计算天麻素的提取率。

1.5 正交试验优化工艺参数

确定料液比、乙醇体积分数、提取时间和提取次数此4个因素作为考察因素，每个因素选择3个水平，每组以5 g原料计算，借助正交设计助手V 3.1软件，进入软件界面选择L9(34)正交表做正交试验(表1)。

表1 正交试验水平与因素设计

1.6 工艺稳定性验证

精密称取天麻粉末3份[12]，每份均为5 g。按醇体积分数65%，料液比1∶16，醇提时间1.5 h，醇提次数4次的工艺参数进行天麻素的提取分离，验证工艺的稳定性。

1.7 统计学方法

全部数据输入计算机用正交设计助手V 3.1软件处理和分析。采用正交设计表进行正交试验的数据分析，采用方差分析对各部分的变异与随机误差进行比较。检验水准α设定为0.05。采用WPS 2013绘制标准曲线。

2 结果

2.1 标准品和供试品溶液色谱图

在1.3.3项色谱条件下，天麻素标准品溶液色谱图为单峰(图1)；天麻素待测品溶液的分离度均≥1，天麻素与其他组分基本分离(图2)。

图1 天麻素标准溶液色谱图

图2 天麻素供试品溶液色谱图

2.2 天麻素标准曲线

天麻素在6.25～200.00 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系(图3)。回归方程y=39.645x-23.125，r=0.999。

图3 天麻素溶液标准曲线图

2.3 方法学验证

2.3.1 稳定性考察 待测品溶液室温分别放置0、2、4、6、8、10、12 h时，得到的天麻素峰面积分别为479.3、462.6、492.6、513.8、452.8、494.5和480.4。天麻素峰面积的RSD值为3.932%。

2.3.2 精密度考察 天麻素标准品浓度的RSD值为0.065%，表明本实验精密度良好(表2)。

表2 精密度实验结果

2.3.3 重复性考察 6份同一批样品得到的天麻素峰面积分别为1452.9、1463.4、1473.6、1432.2、1398.5、1425.3。天麻素峰面积的RSD值为1.754%，表明本实验重复性良好。

2.3.4 加标回收率考察 平均回收率为112.44%，回收率的RSD值为1.246%，表明本实验加样回收率良好(表3)。

表3 加标回收率考察结果

2.4 单因素试验

2.4.1 乙醇体积分数 在乙醇体积分数分别为55%、60%、65%、70%、75%、80%和85%时，天麻素提取率分别为0.450%、0.455%、0.454%、0.493%、0.449%、0.420%和0.356%。当乙醇体积分数为70%时天麻素提取率达到最高值0.493%，随后天麻素提取率逐渐降低。因此，70%为较佳的乙醇体积分数。

2.4.2 料液比 在料液比分别为1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16和1∶18时，天麻素提取率分别为0.398%、0.439%、0.453%、0.471%、0.584%和0.506%。当料液比为1∶16时，天麻素提取率达到最高值0.584%，随后天麻素提取率降低。因此，1∶16为较佳的料液比。

2.4.3 醇提时间 在醇提时间分别为0.5、1、1.5和2 h时，天麻素提取率分别为0.336%、0.410%、0.397%和0.396%。当醇提时间为1 h时，天麻素提取率达到最高值0.410%，随后天麻素提取率缓慢降低。因此，1 h为较佳的醇提时间。

2.4.4 醇提次数 在提取次数分别为2、3、4、5次时，天麻素提取率分别为0.381%、0.493%、0.501%、0.568%。天麻素提取率随提取次数的增加而逐渐增加。综合考虑提取时间和提取成本，选择3次为较佳的提取次数。

2.5 正交试验

由正交实验结果可知(表4)，4种因素对天麻素提取率影响的大小顺序为：A>B>C>D。最优工艺参数条件为：A1B2C2D2，即65%的乙醇体积分数，1∶16的料液比，1.5 h的醇提时间，醇提4次。方差的分析结果(表5)，再次借助正交设计助手V 3.1软件选取离均差平方和最小的因素(D)作为误差项进行方差分析，仅有乙醇的体积分数对天麻素提取率有显著性影响，与文献[6]报道结果相符。

表4 正交试验结果

表5 方差分析表

注：F0.05(2，2)=19

2.6 工艺稳定性

天麻素提取率平均值为1.000%，RSD值为1.986%(表6),表明优化的天麻素提取工艺稳定可靠。

表6 醇提工艺的验证结果(%)

3 讨论

天麻素属于酚苷类化合物，分子量(286.28)较小，极性较大。天麻素能溶于水、甲醇、乙醇、丙酮，不溶于氯仿，因此，水、甲醇、乙醇等均可作为溶剂用于天麻素的溶剂回流提取。水提法耗时耗能，提取时淀粉易糊化，导致后续过滤、浓缩等操作较困难。有机溶剂提取法所需溶剂量较大，生产成本较高，易造成有机溶剂残留和环境污染。综合比较而言，乙醇具有价格低廉、无毒、穿透力强等优点。因此，本研究选择乙醇为天麻素的提取溶剂较为适合。

本研究用单因素法考察了乙醇体积分数、料液比、醇提时间和醇提次数4个因素对天麻素提取率的影响，再利用正交试验法优化单因素法初筛的工艺参数，大大提高了研究效率。正交试验法具有“均匀分散，齐整可比”的特点，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法，但正交试验法也存在精度不高、预测性不佳的缺点。而响应面法采用非线性模型，能求得高精度的回归方程，进行合理预测来找出最佳工艺条件[13]。因此，可进一步将响应面法应用于天麻素提取工艺的优化。

综上所述，乙醇溶剂回流提取法可与酶解提取法、超声提取法、微波提取法等提取技术相结合，以期进一步提高天麻素的提取分离水平。同时，开展天麻素的体外活性评价和药效学研究。相信上述研究工作的开展必将对天麻素系列产品的应用开发和天麻产业的发展起到积极的推动作用。