郭莉娜，李 灿，谭悦浩，孔德华，胡康安，邓峰美△，王航宇，马 燕，刘漪沦

1.成都医学院 基础医学院(成都610500)；2.新疆石河子大学 药学院(石河子832000)；3.成都医学院第一附属医院(成都610500)

肝纤维化是全球常见疾病，主要由病毒性、酒精性、药物性、代谢性、胆汁淤积性等慢性肝脏损伤引起。当这些损伤反复持续存在时，机体发生修复反应，形成了肝脏纤维化。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积是肝纤维化最具特征性的改变，其合成与降解水平失衡是肝纤维化发生的主要原因，这一过程可在一定程度上发生可逆性改变[1-2]。肝纤维化特点是胶原蛋白过度积累和肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)异常激活。当HSC发生激活、增殖和趋化反应后，引起多种促纤维化细胞因子分泌，从而促进胶原合成增加[3]。肝纤维化可发展为肝硬化，甚至肝癌，所以需积极探索其逆转方法。目前，主要治疗肝纤维化的方法是药物治疗，通过减少肝脏持续损伤，逆转肝纤维化。积极探索新药应用于肝纤维化疾病，可以明显减少肝硬化、肝癌发生。

二甲双胍作为双胍类口服降糖药，是治疗2型糖尿病的首选药物，已在临床应用多年[4]。研究[5-6]证明，二甲双胍除降糖作用外，还有抗癌、抗炎、抗衰老等作用。二甲双胍在多囊卵巢综合征临床治疗中已得到认可[7]。在动物实验[8-10]中也证明，该药物对子宫内膜癌、结直肠癌、肝癌等有一定改善作用。近期文献[11]显示，二甲双胍可以治疗小鼠肝纤维化，具体机制需进一步验证。本实验利用CCl4建立小鼠肝纤维化模型，通过二甲双胍进行干预，初步研究二甲双胍对肝纤维化的保护作用及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 雄性C57BL/6J小鼠、SPF级别、4周龄、体重20～25 g。购自成都达硕公司，实验动物生产许可证：SCXK(川)2013-024。实验前动物适应环境1周，饲养条件：温度20～25 ℃，相对湿度35%～40%，自由进食饮水。

1.1.2 细胞 LX-2细胞购自复旦IBS细胞中心，于CO2培养箱内培养。生长环境为：温度37 ℃，CO2浓度5%；给予10%胎牛血清+双抗+DMEM-H培养基，隔天换液，3～5 d传代，于超净工作台进行细胞复苏、换液等操作。

1.1.3 试验药物与试剂 二甲双胍(北京索莱宝生物科技有限公司)；CCL4分析纯AR(500 mL/瓶)(购自成都科龙化工试剂厂)；ALT、AST试剂盒(购自南京建成试剂公司)；HE染色试剂(博谷生物)；天狼星红染色试剂盒(博谷生物)；兔抗α-SMA抗体(中杉金桥)，山羊抗兔IgG(中杉金桥)；DMEM-H培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；双抗购于 R&D公司；PDGF-BB购自美国PeproTech公司；基质胶(Matrigel)购自湖南佳浩能生物科技公司；24孔Transwell小室购自海狸生物科技有限公司等。

1.1.4 实验仪器 组织切片机(RM2016)、组织包埋机(EG1150H)购自LEICA；生物显微镜(CX21FS1C)购自奥林巴斯工业有限公司；Roche Modular D2400生化分析仪购自瑞士Roche公司；倒置相差显微镜购自日本Olympus公司；CO2培养箱购于Thermo公司；超净工作台购于Thermo公司等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药方法 将45只4周龄的小鼠随机分为3组，每组各15只，即正常组、模型组和二甲双胍治疗组；模型组给予橄榄油、CCL4混合物处理，按1∶3比例，经腹腔注射，2 次/周，剂量为0.4 mL/kg；正常组给予相同容量橄榄油，经腹腔注射，2 次/周，剂量为0.4 mL/kg；二甲双胍治疗组造模方法同模型组。造模3周后，给予各组小鼠相对应药物，二甲双胍治疗组给予二甲双胍200 mg/次，1次/d，灌胃；正常组、造模组给予生理盐水，200 mg/次，1 次/d，灌胃，造模6周后处死小鼠，收集标本。

1.2.2 细胞分组与给药方法 将对数生长期的LX-2细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种于12个培养皿中，平均分为4组，即空白对照组、PDGF-BB组、PDGF-BB+Met低剂量组和PDGF-BB+Met高剂量组。空白对照组不做处理；PDGF-BB组给予10 ng/mL的细胞因子PDGF-BB诱导细胞活化；PDGF-BB+Met低剂量组给予10 ng/mL的细胞因子PDGF-BB和5 mmol/L的二甲双胍；PDGF-BB+Met高剂量组给予10 ng/mL的细胞因子PDGF-BB和10 mmol/L的二甲双胍。于48 h后，观察细胞状态，收集各组细胞蛋白。

1.2.3 实验指标测定 检测血清中AST、ALT的含量，实验步骤根据试剂盒说明操作。

1.2.4 组织病理学检测 取出的小鼠肝脏经甲醛固定、石蜡包埋、切片后，行天狼星红染色，将烤片机温度调至65 ℃，在烤片机中将片子复烤约 40 min，二甲苯脱蜡，酒精水化，片子在自来水下轻冲3 min×3 次，标本处滴加天狼星红染色液时间约60 min，自来水冲洗，用 Mayer 苏木素复染细胞核时间约1 min，自来水冲洗7～8 min，进行乙醇脱水处理，将片子放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ透明各 15 min，中性树脂封片，生物显微镜观察拍照。HE染色，烤片、脱蜡、水化步骤同上，染色时先用苏木精染色约3 min，自来水轻轻冲洗4 min，1%盐酸酒精分化15 s，再次用自来水轻冲约1.5 min，氨水反蓝染色1 min，自来水轻轻冲洗约5 min，再用1%伊红染色3 min，再次自来水洗4 min，片子脱水、透明同天狼星红染色，生物显微镜镜检，并拍摄照片。

1.2.5 免疫组织化学染色分析 取5 μm切片，行烤片、脱蜡、水化操作。用EDTA抗原修复液修复抗原。在组织上滴加3%H2O2阻断过氧化物酶活性，使其完全覆盖组织，在37 ℃恒温培养箱孵育0.5 h。滴加已配好的α-SMA抗体(即一抗)，将切片放入湿盒，4 ℃冰箱过夜。次日，取出切片，放入1×PBS中浸泡，3 min/次×3次。切片组织上加山羊抗兔二抗，室温下放置约30 min,1×PBS中浸泡，3 min/次×3次，在组织上滴上二氨基联苯胺显色，苏木素复染3 min,脱水、透明、封片，于显微镜下观察显色情况，选取不同视野拍照。

1.2.6 细胞克隆形成实验 将对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，计数后稀释，将细胞悬液平均种于六孔板中。将六孔板放入CO2培养箱待细胞贴壁，次日将细胞培养基更换为无血清的DMEM约10 h，再次给细胞换液，根据分组给予每孔不同的处理方式，正常组加10%胎牛血清的DMEM培养基，其他组在此基础分别多加入PDGF-BB、PDGF-BB+5 mg/mL Met、PDGF-BB+10 mg/mL Met，每个孔设置3个复孔，当六孔板中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞，时间约15 min，弃固定液，加适量GIMSA应用染色液，时间约20 min，水流轻冲染色液，空气干燥，将六孔板倒置，叠加网格透明胶片，用肉眼直接计数克隆。

1.2.7 Western blot检测 将已处理好的细胞用PBS缓慢冲洗3次后刮下，收集细胞加入离心管中，置于离心机中离心，3 000 r/min，离心半径8 cm，离心5 min，弃上清，得细胞沉淀，加入裂解液，使细胞与裂解液充分混合后，移入EP管，将EP管置于冰面上40 min，每10 min旋转混匀1次，促进细胞裂解，再次离心，条件：4 ℃，12 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心20 min，离心所得上清液即为所需蛋白。使用5×蛋白上样缓冲液混匀蛋白上清后，于95 ℃中加热10 min，待其充分变性。上机跑电泳，随后转膜并置于5%脱脂牛奶中封闭1 h，TBST冲洗，用5%脱脂牛奶稀释α-SMA抗体，将膜浸于其中，封口机封闭，将膜浸于其中，置于4 ℃冰箱过夜；将PVDF膜取出，TBST溶液洗涤，时间10 min,重复3次；稀释山羊抗兔抗体，封口机封闭，置于37 ℃恒温摇床上孵育 2 h，将PVDF膜取出，丢弃二抗，TBST溶液洗涤，时间10 min,重复3次。配置显色液A液和B液，按比例1∶1(体积/体积)，混匀。将显色液均匀滴加与PVDF膜上，置于化学发光显影仪中进行显影。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 肝脏功能的变化

模型组小鼠的肝脏功能相关指标AST、ALT含量较正常组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，二甲双胍治疗组小鼠AST、ALT含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)(图1)。

图1 血清中肝功能相关指标ALT、AST含量注：与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01

2.2 肝脏组织病理学的变化

2.2.1 HE染色 正常小鼠肝脏内肝小叶正常，肝细胞索整齐排列，间质内无炎性细胞浸润；与正常组比较，模型组小鼠汇管区内出现粗大的胶原纤维条索分割包绕，纤维间隔明显增厚，肝小叶结构明显异常，有假小叶形成，肝细胞索排列紊乱，间质内炎性细胞浸润明显；与模型组相比，二甲双胍治疗组胶原纤维的增生减轻，假小叶形成改善，炎性细胞浸润程度减轻(图2)。

图2 肝脏HE染色(×100)注：A：正常组；B：CCL4+PBS组；C：CCL4+二甲双胍组

2.2.2 天狼星红染色 正常组中可见少量胶原分布；与正常组比较，模型组中出现大量胶原沉积，分布广泛，在汇管区间分布较多与模型组比较，二甲双胍治疗组有部分胶原增生，肝小叶中可见少量间隔形成(图3)。

图3 肝脏天狼星红染色(×100)注：A：正常组；B：CCL4+PBS组；C：CCL4+二甲双胍组

2.2.3 免疫组化检测小鼠肝脏组织α-SMA表达 正常组小鼠肝脏基本无α-SMA表达；与正常组比较，模型组α-SMA表达明显增高；与模型组比较，二甲双胍治疗组α-SMA表达降低(图4)。

图4 肝脏α-SMA免疫组化的染色结果(×100)注：A：正常组；B：CCL4+PBS组；C：CCL4+二甲双胍组

2.2.4 细胞克隆形成实验观察细胞增殖能力 与空白对照组比较，PDGF-BB组细胞增殖能力明显升高；与PDGF-BB组比较，PDGF-BB+Met低剂量组细胞增殖能力下降；与PDGF-BB+Met低剂量组比较，PDGF-BB+Met高剂量组细胞增殖能力进一步下降，呈剂量依赖性(图5)。

图5 LX-2细胞克隆形成

2.2.5 二甲双胍能抑制肝星状细胞活化 Western blot检验结果示：与空白对照组比较，PDGF-BB组α-SMA表达明显升高(P<0.01)；与PDGF-BB组比较，PDGF-BB+Met低剂量组α-SMA表达明显降低(P<0.01)；与PDGF-BB+Met低剂量组比较，PDGF-BB+Met高剂量组α-SMA表达进一步降低(P<0.01)(图6)。

图6 Western blot检测二甲双胍干预后LX-2细胞内α-SMA的表达注：A：Western blot检测各组细胞α-SMA的表达；B：各组细胞α-SMA蛋白表达水平统计结果；与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较,##P<0.01；与PDGF-BB+Met低剂量组比较，△△P<0.01

3 讨论

肝纤维化是各种致病因子作用、ECM积累和损伤修复长期持续存在导致的病理过程[12]。肝纤维化损伤修复破坏肝脏正常结构，肝小叶结构出现异常改变，血管结构发生紊乱，同时肝细胞数量减少。各致病因素作用于肝细胞，使其分泌多种细胞生长因子、纤维化相关细胞因子、炎性因子等，从而刺激HSCs活化。HSCs一直被认为是肝纤维化发生发展环节中的最关键因素，其在静息期可调节肝内脂质平衡[13]。HSCs活化后，细胞内脂类丢失，增殖、迁移能力增强，可分泌大量 ECM能力。α-SMA表达量也明显增加，其含量且与细胞活化程度呈正相关。同时,HSCs与周围细胞相互作用，分泌大量细胞因子、趋化因子而促进肝纤维化发生[14]。因此，抑制HSCs活化可有效改善肝纤维化的发生。

肝纤维化最终向肝硬化、肝癌发展。肝癌是一种快速生长的恶性肿瘤，有60%～80%的患者诊断时即为肝癌晚期，且根治性切除机会极少，从而丧失了治疗机会，对人类是一种严重而危险的威胁[15]，肝纤维化可在一定程度上逆转，所以可通过预防或治疗肝纤维化而有效减少肝癌发生。因此，要积极探索肝纤维化治疗新药，迫切需要发现更有效的治疗靶点，以改善治疗效果。

二甲双胍为胰岛素增敏剂，抑制糖异生及肝糖原的分解，是非常有效的降糖药物，现为2型糖尿病治疗首选药物[16]。近年通过流行病学调查研究[17-18]发现，二甲双胍具有保护心血管、抑制肿瘤、治疗非酒精性脂肪肝等作用。二甲双胍可激活蛋白激酶(AMPK)，缓解心脏缺血后的炎性反应，保护心脏功能；AMPK活化还能够抑制多种器官纤维化发生，其中对肝纤维化有明显影响[19-20]。本实验从病理学角度研究二甲双胍对CCL4诱导的小鼠肝纤维化的影响，结果显示，二甲双胍可改善肝脏内炎性细胞浸润，减轻胶原纤维的形成，纤维化病变程度明显减轻。同时，二甲双胍可抑制HSCs活化与增殖。

综上所述，二甲双胍可通过抑制HSCs活化而在一定程度上改善肝纤维化发展，其具体机制需进一步研究发现。