马艳雯，高华利，李倩文，于俊杰，吕志伟

(聊城大学 生命科学学院，山东 聊城 252059)

中国是世界第一的秸秆大国，秸秆资源丰富，每年秸秆产量达到8亿t以上，占全球秸秆总量的20%[1]。随着农村生活水平的不断提高，秸秆作为家庭燃料的利用比例降低，大量秸秆被露天焚烧。秸秆焚烧给环境带来污染，容易引发火灾，给道路带来安全隐患，使得土壤结构遭到破坏，同时也给人类带来极大的危害[2]。纤维素是地球上分布最广、数量最大的可再生资源[3]，玉米秸秆作为中国产量最高的三大作物秸秆之一[4]，富含纤维素，对于研究如何科学高效地利用秸秆资源具有重大的实践意义。

秸秆中含有丰富的有机质，含有氮、磷、钾、钙、镁等元素[5]，是一种绿色的、可持续利用的资源，因此秸秆还田成为一项绿色环保同时又增产增肥的重要举措。但是，目前秸秆还田所面临的问题之一是秸秆资源利用率低，经济效益差。

产纤维素酶的菌很多，近年来报道的有曲霉、木霉、芽孢杆菌、青霉、根霉等[6-10]。如焦有宙等[11]通过比较不同土著菌及其复合菌对玉米秸秆降解的影响，研究出黑曲霉、绿色木霉对秸秆中纤维素、半纤维素体现了较高的降解能力。李立波等[12]探究了哈茨木霉(Trichodermaharzianum)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)这2种菌株在固态发酵条件下降解玉米秸秆的效果。本实验室筛选到一种硫色曲霉，经初步检测，木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶活性较高，并且有研究表明，硫色曲霉固态发酵获得的复合酶系中含有较高活性的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、纤维素酶等，且硫色曲霉对于淀粉、麦麸和豆粕具有良好的降解效果，在饲料酶的生产应用中有很大的潜力[13-15]。然而，目前关于硫色曲霉以秸秆为主要发酵原料进行发酵产酶的研究很少。

因此，本课题研究了不同碳源、氮源、发酵温度、烘干温度、培养时间以及不同初始pH条件对硫色曲霉SQ-3木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶3种酶活性的影响，为硫色曲霉固态发酵产酶的研究填补了的空白，以期获得相对最适的培养条件，为秸秆的高效利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

硫色曲霉SQ-3(AspergillarsulphureusSQ-3)，由聊城大学微生物实验室提供。

1.1.2 试剂

DNS(3，5-二硝基水杨酸)购自国苏集团化学试剂有限公司；羟甲基纤维素和木聚糖购自美国Sigma-Aldrich公司；酒石酸钠、硝酸钠、亚硫酸钠、乙酸、醋酸钠、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁购自天津市光复科技发展有限公司；苯酚、蔗糖、淀粉、蛋白胨和琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 实验方法

将硫色曲霉SQ-3接到察氏培养基上，培养3 d，进行活化。之后将菌种接到种子培养基(即初始培养基，麦麸33.2%，豆粕5.8%，玉米秸秆粉1.0%，1% NaNO3溶液 60%)上，28 ℃培养3 d，待用。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 酶活性的定义与测定

酶活性定义为每分钟催化释放产生1 μmol还原糖(葡萄糖、麦芽糖、木糖)所需的酶量为1个纤维素酶、淀粉酶和木聚糖酶活性单位(U)。

将发酵培养基置于37 ℃和-20 ℃下冻融3次，加入3倍体积的水，摇床萃取，抽滤，取滤液采用DNS法[16-17]测定酶活性。将抽滤后的发酵料于60 ℃烘干至恒重以计算活性，单位为U·g-1。

1.3.2 相对酶活性的计算

相对酶活性的计算公式A=Ex/Emax×100%。其中，A—相对酶活性；Ex—样品酶活性；Emax—实验条件下每组中的最高酶活性。

1.3.3 培养时间对发酵产酶的影响

采用初始培养基，接种后在28 ℃、初始pH为7.0的条件下分别培养1、2、3、4、5、6 d，提取酶液分别测定发酵产物的酶活性，以确定适宜的发酵培养时间。

1.3.4 初始pH值对发酵产酶的影响

将初始培养基pH值调整为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他条件不变，分别测定酶活性。

1.3.5 发酵温度对发酵产酶的影响

将初始培养基培养温度分别设为24、28、32和36 ℃，其他条件不变，分别测定酶活性。

1.3.6 不同氮源、碳源对发酵产物酶活性的影响

分别改变初始培养基中豆粕、蛋白胨、麦麸和玉米秸秆粉的含量，培养时间为3 d，其他条件不变，分别测定酶活性(具体培养基成分见表1)。

1.3.7 烘干温度对发酵产物酶活性的影响

综合1.3.3节-1.3.6节不同培养条件对硫色曲霉产酶活性的影响，选取相对最适的培养条件(表1，C4组)，将得到的发酵料分别置于40、45、50、55、60 ℃的烘箱中烘干至恒重，进行残余酶活性的测定。

1.3.8 烘干温度对孢子存活数的影响

利用稀释平板法[18]测定孢子存活数并进行孢子计数。培养条件同1.3.7节，将得到的发酵料分别置于40、45、50、55、60、65 ℃下烘干至恒重，测定孢子数。

1.4 数据分析

采用Origin 8.0进行作图，利用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2007对结果进行数据统计和分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养时间对硫色曲霉SQ-3酶活性的影响

由图1可知，木聚糖酶的活性在第2天即达最高峰，纤维素酶和淀粉酶分别在第3天和第5天时达到最高峰，之后均开始下降。在第3天时，木聚糖酶活性为最高酶活力的68.7%，淀粉酶活性为最高酶活力的85.1%，是3种酶活性均相对较高的产酶时间。

图1 不同培养时间对硫色曲霉SQ-3酶活性的影响Fig.1 Effects of different culture time on activities of cellulase， amylase and xylanase produced by Aspergillar sulphureus SQ-3

2.2 不同初始pH值对硫色曲霉SQ-3三种酶活性的影响

图2显示了在不同初始pH值条件下，硫色曲霉SQ-3三种酶活性的变化趋势。在初始pH值为酸性及近中性的条件(pH 4.0～7.0)下，木聚糖酶活性变化较小，在初始pH 7.0时相对酶活性最高。在初始pH值为偏碱性的环境下活性迅速下降。纤维素酶和淀粉酶活性都呈先上升后下降的趋势，分别在初始pH 7.0和pH 6.0的条件下相对酶活性最高。在pH 7.0时，淀粉酶活性为最高酶活性的95.7%。

2.3 不同培养温度对硫色曲霉SQ-3三种酶活性的影响

不同的培养温度对3种酶会产生不同的影响。

图2 不同初始pH值对硫色曲霉SQ-3酶活性的影响Fig.2 Effects of different initial pH values on activities of cellulase， amylase and xylanase produced by Aspergillar sulphureus SQ-3

图3 不同培养温度对硫色曲霉酶活性的影响Fig.3 Effects of different culture temperature on activities of cellulase， amylase and xylanase produced by Aspergillar sulphureus SQ-3

木聚糖酶在24 ℃的条件下相对酶活性最高，随着培养温度的上升，酶活性呈现出一直下降的趋势。纤维素酶和淀粉酶活性呈先上升后下降的趋势，在28 ℃的条件下最高；在此条件下，木聚糖酶为最高酶活性的88.9%(图3)。

2.4 不同氮源、碳源对发酵产物酶活性的影响

由表1可知，在N1-N6组中，以豆粕为氮源时，纤维素酶与淀粉酶的活性受豆粕含量影响较大，木聚糖酶活性受影响较小。以蛋白胨为氮源时，随着氮源含量的增加，纤维素酶活性升高，木聚糖酶与淀粉酶活性降低。在C1-C5组中，改变麦麸与玉米秸秆粉的比例，可见，C4组中木聚糖酶与纤维素酶活性最大，而淀粉酶活性在C1组中最大(P<0.05)。

2.5 不同烘干温度对硫色曲霉三种酶活性的影响

不同的烘干温度对硫色曲霉SQ-3发酵料中的酶活性具有显著影响。随着烘干温度的升高，木聚糖酶活性迅速下降，在烘干温度为40 ℃时相对酶活性最高；淀粉酶和纤维素酶的相对酶活性先升高后降低，分别在45 ℃、50 ℃时达到最高酶活性。在50 ℃下，木聚糖酶活性仅为最高酶活性的37.8%，淀粉酶活性则为最高酶活性的91.9%(图4)。

2.6 不同烘干温度对孢子活性的影响

由图5可知，孢子存活数受温度的影响较大。随着烘干温度的升高，活孢子数明显下降，在烘干温度为40 ℃时，活孢子数不低于1.1×108g-1，在45 ℃时，活孢子数则迅速下降到40 ℃时的18.4%。

表1 不同氮源、碳源对发酵产物酶活的影响

Table1Effects of different nitrogen sources and carbon sources on enzyme activity of fermentation production

序号Test No.麦麸Wheatbran/%玉米秸秆粉Corn strawPowder/%豆粕Soybeanmeal/%蛋白胨Peptone/%1% NaNO3/%纤维素酶Cellulase/(U·g-1)木聚糖酶Xylanase/(104 U·g-1)淀粉酶Amylase/(103 U·g-1)N136.91.02.10.060.0259.3±13.3 b9.1±0.5 a10.0±0.9 aN235.01.04.00.060.0238.3±12.6 b7.4±0.1 c8.7±0.1 bN333.21.05.80.060.0362.7±35.2 a9.9±0.3 a8.5±0.5 beN436.91.00.02.160.0300.3±42.0 a9.4±0.4 a8.4±0.6 beN535.01.00.04.060.0332.6±40.8 a7.9±0.0 b7.8±0.2 ceN633.21.00.05.860.0410.8±70.3 a6.5±0.0 d7.1±0.2 dC133.21.05.80.060.0362.7±35.2 ae9.9±0.3 ce8.5±0.5 aC224.79.55.80.060.0335.8±15.7 be10.9±0.9 be6.2±0.5 bC316.717.35.80.060.0281.3±3.7 c11.7±0.4 b5.4±0.4 bC48.525.75.80.060.0453.3±66.6 a14.8±0.2 a3.9±0.1 c

同列不同行数据后没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

The data within the same column followed without the same letters indicated significant difference atP<0.05.

图4 不同烘干温度对硫色曲霉酶活性的影响Fig.4 Effects of different baking temperature on activities of cellulase， amylase and xylanase produced by Aspergillar sulphureus SQ-3

图5 不同烘干温度对孢子活性的影响Fig.5 Effect of different baking temperature on survivability of this fungus

3 讨论

硫色曲霉能够在以秸秆为主要成分的发酵培养基中快速生长，在第2天时，发酵料中木聚糖酶活性达最高峰，纤维素酶在第3天达到最高峰，与陆文清等[13]相关研究报道相比，实验所需的产酶时间较短、酶活力较强、产酶效率较高(表1)。

环境中的pH值会影响到细胞膜所带电荷量，从而引起细胞对营养物质吸收状况的变化[19]。图2结果显示，初始pH值为6.0～7.0偏中性时，3种酶的活性均较高，其中3种酶活性在pH值为7.0时均最高，此前已有报道证实[20-21]。该实验条件有助于简化固体发酵产酶的工序，使得工业化生产成为可能。

由图3可知，在28 ℃下，木聚糖酶活性为最高酶活性的88.9%，淀粉酶活性为最高酶活性的83.9%，纤维素酶活性达到最大，与有关报道[22-23]结果基本一致，属于室温的温度范围。因此，在实际生产过程中，可有助于减少能源消耗。

由表1可知，相对于蛋白胨，氮源为豆粕(占5.8%)时，酶活性仍较高，可以作为主要氮源以降低生产成本。碳源主要为玉米秸秆粉(占25.7%)时，纤维素酶与木聚糖酶活性最大，淀粉酶活性也较高。相对于此前报道的利用玉米芯产木聚糖酶[24]的实验，本实验利用农业废弃物玉米秸秆培养硫色曲霉时产酶量更高，对秸秆还田及工业生产具有重要的实际意义。

纤维素酶比较耐热，在50 ℃下烘干时的活性最大，而木聚糖酶的耐热性较差(仅为最高酶活力的37.8%)，淀粉酶则保存了91.9%的活性。纤维素酶对于纤维素分子的降解，一般要吸附到纤维素上，并且纤维素酶的吸附力与相关水解活力没有线性关系[25]，纤维素酶在烘干温度为50 ℃条件下的活性最高，这一结果与相关文献报道一致[26]。这可能是因为温度的提高降低了纤维素酶对于秸秆的吸附力，也有可能是因为温度的提高破坏了细胞的结构，使得纤维素酶释放出来，对于纤维素酶吸附机制还有待于进一步研究。

对于真菌孢子的保存一般采用低温烘干保存法，并且低温烘干后可以保存数月之久[27]。在烘干温度为40 ℃时孢子存活数最高，考虑到含水量高使得孢子代谢旺盛，更容易导致孢子死亡，因此本实验建议在40 ℃的温度下烘干后，低温保存，可以减少孢子的损耗。

根据以上结果，考虑到实际生产中的秸秆分解效率和成本，以对秸秆降解起主要作用的纤维素酶为基准，综合考虑木聚糖酶和淀粉酶的相对最适条件，可选定硫色曲霉SQ-3培养的相对最适条件(即：培养时间为3 d，培养温度为28 ℃，初始pH为7.0；固体发酵配方：玉米秸秆粉为25.7%，豆粕为5.8%，麦麸为8.5%，1% NaNO3溶液为60%)。在此条件下培养，纤维素酶活性为453.3 U·g-1，淀粉酶活性为3.9×103U·g-1，木聚糖酶活性为1.48×105U·g-1。对发酵料进行烘干时，宜选用低温(40 ℃)烘干，以最大限度保存3种酶的活性和孢子活性。相关结果可为秸秆的回收利用、木聚糖酶和纤维素酶工业化生产提供一定的数据。