邓晓瑜 张倩倩 侯凤春 徐山山 张帆 于艳玲

随着人们生活水平和美观意识的不断提高，成年人正畸治疗需求量日益增加[1]。无托槽隐形矫治作为正畸学领域出现的一种新兴的治疗理念和技术，更顺应了人们追求美观、舒适、健康的现代治疗观念[2-3]。Karkhanechi等[4]研究表明，隐形矫治技术不存在托槽，弓丝等复杂的装置，口腔卫生维护相对比较好，对牙周健康更具有优势。但是一体化覆盖于牙面改变了龈上菌斑的生存环境，也可能对牙周健康存在一定程度的影响。所以本实验通过隐形矫治和固定矫治的牙周指数及牙周菌群的对比，探讨两种不同的矫治技术对牙周健康的影响是否存在差异。

1 资料与方法

1.1 病例选择

纳入2017-06～2018-05青岛市口腔医院正畸科患者60 例。30 例固定矫治患者为A组，采用Gemini MBT金属正畸托槽(3M， 美国)，男性13 例，女性17 例， 平均年龄(25±5.3) 岁； 30 例无托槽隐形矫治患者为B组， 采用Invisalign隐形矫治器(Align Technology公司， 美国)，男性16 例， 女性14 例，平均年龄(30±8.6) 岁。

纳入标准：①患者年龄18～35 岁；②下前牙无拥挤或轻度拥挤，正畸治疗前均无龋齿或龋齿已充填；③牙龈色形质正常，无附着丧失，正畸治疗前均进行龈上洁治术； ④所有受试者均进行相同的口腔卫生宣教，能严格遵守早晚刷牙，刷牙时间不少于 5 min； ⑤无全身系统性疾病，女性患者非妊娠或哺乳期；实验前3 个月内未服用激素或抗菌药物；⑥经患者本人同意试验且能按时复诊者。

1.2 临床牙周检查

由同1 名接受过专业培训的牙周医师分别对治疗前，治疗3 个月，治疗6 个月的牙周指数进行检测，对所有受试者的4 颗下颌中切牙，每颗牙3 个位点(包括近中颊点，正中位点，远中颊点)共12 个位点进行检查，每个位点测量3 次取平均值，个人记数为12 个位点记数的平均值。检测指标包括牙龈菌斑指数(plaque index，PLI)，探诊深度 (probing depth，PD)和牙龈指数(gingival index，GI)，方法参照《临床牙周病学》第2版[5]。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集 龈沟液样本的收集：每位受检者复诊前常规BASS法刷牙，棉卷隔湿，吹干牙面，将无菌纸尖伸入龈沟内，插入至有阻力，静置35 s后取出放入1.5 ml EP管中，加入1ml PBS溶液后保存在-20 ℃冻存，受血渍和唾液污染则弃之。

1.3.2 标准菌株及龈沟液 DNA提取 按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明进行龈沟液样品中细菌基因组DNA的提取。用超微量UV/可见光分光光度计对样品浓度及纯度进行测定。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测 首先根据牙龈卟啉单胞菌(NR_074234)(Porphyromonasgingivalis,Pg)、福赛坦氏菌(NR_074140)(Tannerellaforsythiain,Tf)16S rRNA序列的可变区设计其各自的特异引物，同时参考荧光假单胞菌、副溶血弧菌、大肠杆菌等细菌16S rRNA序列的保守区设计细菌的通用引物。经序列分析及预实验溶解曲线分析，引物具有良好的特异性，合成引物序列见表 1。

表 1 引物序列

其次，采用实用荧光定量PCR仪(ThermoFisher, Pikoreal96， 美国)进行定量检测， 10 μl反应体系包括2×的反应预混液5 μl， 上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl， 模板1 μl， 水3.2 μl； 反应程序： 95 ℃ 7 min； (95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s， 收集荧光信号)40 个循环； 60 ℃ 30 s； 60～95 ℃(0.2 ℃/s)逐渐升温收集溶解曲线荧光信号； 20 ℃ 10 s。

最后绘制标准曲线：分别将通用菌、Pg及Tf的标准品DNA按10 倍梯度进行系列稀释，作为荧光定量PCR实验绘制标准曲线的阳性模板。将标准品与待测样品同时进行荧光定量PCR反应，以不同浓度阳性模板的拷贝数的对数为横坐标，以PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数(Cq)为纵坐标绘制标准曲线。将待测样品的Cq值带入标准曲线获得其拷贝数。每个样本检测设3 个复孔。

1.4 统计学方法

用SAS 9.2统计软件进行统计学分析，以P=0.05为检验标准。患者戴入矫治器前测量的数据作为基线，组内比较临床牙周指数、Pg和Tf构成比在不同观测点的变化，进行方差分析及多重比较；组间对比不同时间点的各项检测结果，采用t检验进行对比分析。

2 结 果

2.1 临床牙周指数的检查结果

治疗前A组和B组的口腔卫生良好，牙龈边缘无明显菌斑，牙龈健康，牙周探针深度小于2 mm， 2 组的牙周指数(PLI、 GI、 PD)无统计学意义(P>0.05)；在治疗3 个月， 2 组的下切牙近龈缘区可见不同程度的菌斑堆积，牙龈色泽的改变，牙周探诊深度增加但小于2 mm， B组牙周指数在各个时期均低于实验A组，差异有统计学意义(P<0.05)； 治疗6 个月，A组的牙周指数持续上升， B组的部分牙周指数呈下降趋势， B组的指数均低于A组，PD差异显著性意义(P<0.01)(表 2～4)。

2.2 Pg和Tf的检查结果

治疗前， 组间对比Pg和Tf的构成比， 差异无统计学意义(P>0.05)； 治疗3 个月， B组的Pg构成比低于实验A组，差异有统计学意义(P<0.05)，Tf的构成比无统计学意义(P>0.05)；治疗6 个月，组间对比Pg和Tf的构成比均无统计学差异(P>0.05)。

表 2 T0期2 组牙周指数比较

表 3 T3期2 组牙周指数比较

表 4 T6期2 组牙周指数比较

组内不同时间点对比，A组的Pg的构成比在治疗3 个月达到高峰，随着时间延长在治疗6 个月呈下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)； B组的Pg的构成比变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)； A组和B组Tf的构成比均无统计学差异(P>0.05)(表 5～6)。

3 讨 论

对于正畸治疗是否会造成牙周的损害一直存在较大争议。Levrini等[6]认为缺乏证据证明正畸治疗会对牙周健康造成一定的影响，但是Harradine[7]表明固定矫治装置会改变口腔微生态环境，增加牙周炎的风险。Lu等[8]认为隐形矫治比固定矫治更有利于维护牙周健康，牙齿更接近整体运动，可以防止龈上菌斑从牙龈转移到龈下破坏牙周组织。本实验选择两组不同矫治器的患者，口腔卫生状况和依从性良好，排除青春期激素水平和各种社会环境等影响牙周健康的因素，以增加试验数据的可靠性。

表 5 Pg百分含量方差分析表

表 6 Tf百分含量方差分析表

牙菌斑生物膜是牙周病最主要的致病因素，菌斑的细菌及其产物是引发牙周病必不可少的始动因子[9]。Pg是牙周炎病变区中最主要的优势菌群，Tf常在重度牙周炎附着丧失处的龈下菌斑中检出，且与Pg存在着共生关系。随着龈下菌斑中革兰阴性厌氧菌种类和数量的增多，机体免疫的抵抗与修复同细菌破环之间的平衡被打破，继而出现牙龈炎症，甚至向下破坏导致牙周附着丧失[10]。因此，对于细菌的检测是非常有必要的[11]。聚合酶链反应(PCR)是通过酶促反应在体外扩增特异DNA片段的一种技术方法，可直接用于菌斑、龈沟液、唾液或牙周组织样本微生物的微量DNA检测[12]，应用敏感性和特异性高的DNA技术,在超过1/3的个体中可检测到Pg等牙周可疑致病菌[12-13]。而传统的细菌培养法研究低估了牙周致病菌的发生率， 限制了临床的应用[9]。

本实验研究结果显示，无论是固定矫治还是隐形矫治的牙周指数均随着矫治的开始而逐渐上升，到3 个月时达到高峰，并在之后的矫治中维持治疗前的水平或略降低。Lindel等[14]研究表明初戴矫治器时，矫治器周围会形成初始生物膜，宿主产生免疫反应，牙齿在受到持续力的作用下会发生一过性的牙龈炎症，导致临床牙周指数值升高。同时也可以看到A组的Pg的构成比也在矫治3 个月达到高峰，之后呈下降趋势。这说明Pg的构成比与牙周指数呈正相关。Kawada等[15]应用定量PCR方法同样也发现Pg数量随牙周指数的升高而增加。从临床试验观察，固定矫治器等复杂装置还是会影响牙齿的自洁，容易堆积菌斑，但是随着每次复诊口腔卫生的深入指导， A组在第6 个月时，细菌的构成比和牙周指数降低或维持稳定。B组的Pg构成比随着时间延长变化不显著，在治疗3个月呈略微降低趋势，更加说明隐形矫治可摘戴的方式有利于患者自洁，这也跟患者更加注重刷牙，使用牙线等维护口腔健康的方式有关。 2 组的Tf的构成比变化不显著，无统计学差异(P>0.05)，有研究表明Tf常常出现在严重的牙周炎患者中，说明2 种矫治器在维护良好的口腔卫生条件下并没有对牙周组织造成不可逆的损害[16-17]。

综上，本实验通过了牙周致病菌的检测，发现两种矫治方式在第6 个月和矫治前相比牙周状况较稳定，说明牙周定植菌和宿主固有免疫之间达到了动态平衡，也可能由于牙齿排齐更有利于口腔卫生的; 2 组患者在重视口腔卫生的情况下，两种矫治方式均能维持牙周的健康。从牙周指数及菌群变化看出，固定矫治器第3 个月达到高峰，隐形矫治变化不显著，说明隐形矫治更有利于口腔卫生的维护。