董小琳 柳志文

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔中最常见的恶性肿瘤，威胁着人们的健康和生命[1]。而口腔黏膜白斑(oral leukoplakia,OLK)为最常见的癌前病变，研究显示，OSCC 中约有 17%～35%是由OLK发展而来[2]。早期诊断治疗OLK恶变对预防OSCC发生有积极作用。目前已有相当研究证明自噬可通过促进细胞死亡而导致癌变，近年来由于其在细胞稳态中的显著作用，尤其是在癌症的发病机制及治疗中的作用而备受关注[3]。微管相关蛋白1 轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3，LC3)是自噬体膜在形成过程中必不可少的基因，其模型LC3B的含量与自噬发生程度呈正相关，由于其特殊性自噬体及以往在OSCC中表达被选定为研究对象[4],用于衡量自噬活性[5]，雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR) 在自噬通路中作为逆向调控者，是负向调节细胞自噬的核心基因。本研究旨在通过检测上述自噬关键基因在OLK和OSCC中的表达，探讨其与OLK癌变的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集2016-12～2017-11湖南省长沙市湘雅口腔医院病理科蜡块，包括OLK组织120 例和OSCC组织30 例。OLK组织根据组织病理学改变划分为“单纯增生”(30 例)和“异常增生”(90 例)，“异常增生”根据其程度划分为“轻度异常”、“中度异常”和“重度异常”，各30 例，并收集其临床资料，包括患者年龄、性别、发病部位、是否吸烟及临床分型。另收集手术切除的正常黏膜20 例，常规石蜡包埋。所有患者术前均未进行激素、化疗、放疗，且无自身系统性疾病。研究对象均签署知情同意书并纳入研究，本试验获得中南大学湘雅二医院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂 兔抗人LC3B(ab48394， 1∶300)、 mTOR(ab32028， 1∶400)抗体(Abcam公司， 美国)； 免疫组化Super Vision试剂盒(SV0002， 武汉博士德生物技术有限公司)； DAB显色剂盒(NA， 北京嘉美生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化法检测LC3B和mTOR的表达 将石蜡标本3 μm 连续切片，烘干，脱蜡、至水，枸橼酸微波抗原修复， 3% H2O2常温孵育30 min，避免内源性过氧化物酶活性干扰;磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗， 5% BSA 封闭，加一抗， 4 ℃过夜，复温后PBS冲洗，滴加聚合HRP标记抗兔IgG 37 ℃孵育30 min，DAB 显色，苏木精复染， 1%盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片。用已知的阳性照片作为阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照。实验按试剂盒说明书进行。

1.2.2 免疫组化结果判定 两人双盲阅片，随机选取5 个视野观察(× 400)，根据染色强度计分及阳性细胞百分比计分对染色结果进行半定量分析，结果取平均值。LC3B 和 mTOR 均以细胞膜和(或)细胞质染成棕黄色为阳性细胞。A：染色强度分为： 0(无染色)， 1(淡黄色)， 2(黄色)， 3(棕黄色)； B：阳性细胞的比例评分：1(0～10%)， 2(10%～50%)， 3(50%～100%)。最后评分为：A×B。 1～3 分为阴性，记(-)，≥4 分为阳性，其中4～5 分记(+)，6～8 分记(++)，9 分及以上记(+++)。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件处理数据。LC3B、mTOR在组织中的表达强度比较采用秩和检验，其余计数资料采用卡方检验，相关性通过Spearman相关性分析实现。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 LC3B在不同组织中表达

LC3B的表达主要见于上皮基底层、棘层、颗粒层及固有层浅层的细胞，其染色部位主要定位于细胞质及细胞核(图 1)，在正常口腔黏膜、OLK及OSCC组织中的阳性率分别为85.0%(17/20)、65.8%(79/120)和33.3%(10/30),结果有显著性差异(P<0.01，表 1)。在OLK各病理分型中，LC3B表达率分别为单纯性增生83.3%(25/30)、轻度异常73.3%(22/30)、中度异常56.7%(17/30)、重度异常50.0%(15/30)，差异有统计学意义(P<0.05， 表 1)。

图 1 LC3B在各组中的表达

2.2 mTOR在不同组织中表达

mTOR的表达主要见于上皮全层，少数见于固有层及结缔组织浅层细胞，阳性表达均位于细胞质(图 2)，在正常口腔黏膜、OLK及OSCC组织中的阳性率分别为20.0%(4/20)、48.3%(58/120)和76.7%(23/30)，结果有统计学意义(P<0.01， 表 1)。而在OLK组织内，mTOR表达率分别为单纯性增生36.7%(11/30)、轻度异常40.0%(12/30)、中度异常53.3%(16/30)、重度异常63.3%(19/30),但差异不具有显著性(P>0.05， 表 1)。

2.3 LC3B和mTOR在组织中表达的相关性

双变量相关分析, LC3B阳性率的逐渐下降与组织恶性度显著负相关(r=-1.000，P<0.01)， mTOR 阳性率的逐渐升高与组织恶性度显著正相关(r=1.000，P<0.01)； LC3B阳性表达率和mTOR 阳性表达率显著负相关(r=-0.970，P<0.01， 图 3)。

2.4 LC3B和mTOR在组织中的表达类型及相关性

LC3B和mTOR在组织中的表达有4 种情况,分别将其概括为如下3 种类型(表 2)： 正常表达(LC3B+mTOR-)、单异常表达(LC3B+mTOR+或LC3B-mTOR-)、双异常表达(LC3B-mTOR+)。随着组织恶性度的增高, LC3B和mTOR正常表达的病例比率逐渐降低(r=-1.000,P<0.01， 图 3), 单异常表达以及双异常表达的病例比率均逐渐增高(r=1.000,P<0.01，图 3)。双变量相关分析,正常表达与单异常表达、双异常表达的病例比率均显著负相关(r=-0.975和-0.984，P<0.01， 图 3)，单异常表达与双异常表达病例比率显著正相关(r=0.920，P<0.01， 图 3)。

表 1 LC3B和mTOR在不同口腔组织中的表达强度

注： LC3B：正常黏膜组与OLK组，Z=-2.704，P=0.007； OLK组与OSCC组，Z=-3.791，P=0.000。 mTOR：正常黏膜组与OLK组，Z=-2.649，P=0.008； OLK组与OSCC组，Z=-3.729，P=0.000； OLK单纯增生、轻度异常增生、中度异常增生与重度异常增生组间比较， ①：P<0.05； ②：P>0.05

图 2 mTOR在各组中的表达

注： LC3B与mTOR表达相关性， r=-0.970， P<0.01

2.5 OLK组LC3B和mTOR表达与临床因素的相关性

表 2结果可见，LC3B和mTOR的表达在患者年龄、性别、病变部位及吸烟史的差异均无统计学意义(P>0.05)，在临床类型上表现出显著性差异(P<0.05)。

2.6 OLK与临床因素的关系

表 3显示OLK增生程度与患者性别、病变部位、吸烟史及临床类型的差异均有统计学意义(P<0.05)，在年龄上没有表现出显著性差异(P>0.05)。

3 讨 论

自噬是真核细胞为维持细胞稳态的一种降解过程，近年来发现，自噬的发生受多种自噬基因调控，该调控机制失调与肿瘤发生、进展等多种病理过程密切相关[6]。LC3B为LC3表达产物LC3A与磷脂酰乙醇胺结合形成的膜型，其含量与自噬发生程度正相关，被认为是判定自噬活性的特异性灵敏标志分子[7]。 有报道LC3B的表达与多种癌症相关，其中包括乳腺癌、结直肠癌、胃癌和口腔鳞状细胞癌等[8-9]。PI3K/AKT/mTOR通路是研究最多的一种癌前及致癌途径， 该通路的过度激活与许多关键的癌症行为有关[10]。其中的关键基因mTOR 能感受诸多信号的作用，为自噬功能的中心调控者，逆向调控自噬诱导及自噬体形成。目前，二者在肿瘤领域的研究处于不断深入中，已有初步研究表明其与宫颈癌[11]、结肠癌[12]等恶性肿瘤中存在相关性，而在OLK恶变中的相关性尚不明确。

表 2 LC3B、 mTOR的表达与白斑临床因素的关系

表 3 白斑与临床因素的关系 (n=30)

Tab 3 Correlation of OLK with clinical factors

(n=30)

本研究中LC3B在口腔正常黏膜、OLK及OSCC中阳性率逐渐降低，且在OLK由单纯性增生到重度异常增生各分型中，阳性率依次降低，差异性均显著，表明随组织恶性程度增加，自噬表达相对不足，推测这种不足可能与其上皮异常增生的严重程度有关，提示异型性明显的细胞可能逃脱了自噬消除甚至抑制了自噬活性,而单纯增生中的高水平自噬则起到了保护作用，从而在一定程度上缓解了黏膜的恶变倾向。LC3B阳性率与组织恶性程度呈显著负相关，表明其失活可以预示口腔黏膜恶变的进程。同时，LC3B随OLK异常增生程度增大失活增加，提示LC3B失活是存在于癌前病变中的早发事件，可以考虑作为检测早期癌变的指标之一。

mTOR作为自噬抑制性通路PI3K/AKT/mTOR的关键基因，在本研究中的阳性率与口腔黏膜恶性程度呈显著性正相关，提示PI3K/AKT/mTOR通路的激活[13]可能加速OLK的恶化。在白斑组织中，mTOR随异常增生程度增大而表达增加，自噬抑制增强，自噬活性降低。但只在单纯性增生与重度异常增生间有显著性差异(P<0.05)，可见mTOR过表达在口腔黏膜恶变进程有预测作用，而在OLK中检测到mTOR表达量显著增加说明其癌变性大大增加，因此，也提示对于早期OLK癌变的检测作用也许并不明显。在口腔黏膜恶变进程中，LC3B缺失率与mTOR阳性率呈显著性正相关，说明二者均与口腔癌变进程相关，这与张晶等[11]在宫颈癌的研究结果一致。再进一步分析其相关性发现，不论LC3B、mTOR单独或者同时异常表达，随组织恶性程度增加，失活表达(LC3B-、mTOR+)频率增加。而单异常表达与双异常表达正相关(P<0.05)，且均与正常表达呈负相关(P<0.05)，说明LC3B与mTOR失活在OLK发展到OSCC过程有协同作用，这一发现在国内外对于OLK恶变研究中未曾有报道。但单异常表达比率始终高于双异常，因而是否存在叠加关系，并不能完全确定，还需进一步研究。

分析LC3B和mTOR表达与OLK患者临床因素的关系，发现在年龄、性别、发病部位及吸烟史方面均无统计学意义(P>0.05)，而在临床类型上差异性显著(P<0.05)，可见非均质型OLK更易出现LC3B表达的缺失及mTOR的过表达，自噬水平降低的发生率更高，恶性程度也随之增大，这与以往的研究报道一致。值得注意的是，表 3中将OLK按病理改变分类后，分析其与临床因素的关系，发现之前无统计学意义的因素，如性别、发病部位、吸烟史与OLK恶变进程有关，结果有统计学意义。分析这种改变产生的原因，一方面，可能由于本研究样本量相对较小，在LC3B和mTOR表达上未显现出阳性结果；另一方面，考虑OLK患者中存在自噬水平的差异，而在不同的临床因素组中，参数分布不均，差异参差不齐，很有可能影响实验结果。对于年龄因素，均未表现出显著性差异。虽然50岁以上患者人数比例逐渐增多，且始终高于50 岁以下患者，但没有统计学意义。且年龄因素在以往报道中也存在分歧，考虑可能受样本量的限制，也可能受其他不确定因素影响，如患者的文化水平、经济状况、健康敏感度等不同，导致就诊及时程度不同，因而尚不能断定出现的阴性结果意味着毫无差异。由于上皮异常增生常见于非均质型白斑中，两者皆与OLK恶变有关，临床医生遇到此类患者应给予高度重视，对于年龄、性别、发病部位及吸烟史，可作为辅助指标，在临床上也应适当考虑。

综上所述，本实验发现自噬相关基因LC3B 和mTOR的异常表达与口腔白斑及其恶变密切相关。随着病变的进展，LC3B 表达下调，mTOR表达上调，提示自噬缺陷越明显。临床上，应警惕非均质型白斑，结合临床因素，联合检测LC3B与mTOR的表达有助于评估口腔白斑进展程度。鉴于本研究尚存在局限性，期待设计严谨、样本量充足的前瞻性研究，深入阐明自噬与白斑恶变间的关系，为临床工作提供参考。