崔宇平 马洪 段晓峰 孙昆俊

口腔癌是世界第六大癌症，全球平均每年临床上确诊的发病人数约500 000 人，癌症晚期的患者存活率低(5 年生存率大约10%～30%)[1-2]，在我国， 每10 万名癌症患者中罹患口腔癌疾病率为男性8.7/10 万， 女性6.0/10 万，相关研究表明，口腔癌的发生与发展是多基因疾病、环境及遗传因素共同参与的结果[3-7]。近年来相关临床研究表明，细胞周期蛋白B1(cyclin B1,CCNB1)基因在乳腺癌、卵巢癌、直肠癌等多种肿瘤组织中高表达。本次研究通过Real Time PCR技术检测CCNB1 mRNA分别在正常口腔黏膜组织及口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达情况，并比较其在OSCC中不同的临床特征是否有表达差异，为OSCC的早期发现及诊断提供相关依据。

1 资料与方法

1.1 组织标本

标本来自贵州医科大学附属医院及贵州省肿瘤医院口腔颌面外科手术切除的新鲜组织(患者年龄≥18 岁)，患者术前检查均无全身系统性疾病;正常口腔黏膜组织取自拔牙患者;所有42 例OSCC组织及17 例正常组织,离体后立即用RNA later液暂封, 4 ℃冰箱过夜，-80°C冰箱保存。收集时间 2016-06～2017-01。

1.2 引物合成

根据参考文献确定内参基因序列及引物[8]。CCNB1，上游序列：catggtgcactttcctcctt；下游序列：aggtaatgttgtagagttggtgtcc。内参基因GAPDH，上游序列：cttagcacccctggccaag；下游序列:gatgttctggagagccccg。

1.3 主要试剂及Real-time PCR技术

切取2～3 mm3大小组织, 利用Dynabeads®Rm-RNA DIRECTTM试剂盒(Roche公司,美国)， 使用磁珠法提取组织中mRNA, 用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒(Roche公司)逆转录成cDNA(-20 ℃冰箱储存备用)。再用LightCycler®R480 SYBR Green I Master(Roche公司)进行扩增,采用10 μl反应 体系: SYBR Green I Master 5 μl, 上下游引物4.0 μl, 模板1 μl。反应条件为:预变性95 ℃, 1 min;变性95 ℃, 10 s; 退火65 ℃, 30 s, 共64 个循环。每个样品7 个复孔,取CT平均值,采用 2-ΔΔCT法进行结果分析。

1.4 统计学处理

检测结果结合临床资料数据, 应用SPSS 19.0软件包进行统计学分析,P<0.05认为有统计学意义。

2 结 果

结果表明, 42 例OSCC及17 例口腔正常黏膜组织相对表达量分别为: (1.336 0±0.675 9), (0.035 9±0.023 8),t=12.446,P<0.05。其中OSCC组织中,不同临床特征间比较结果(表 1)所示，CCNB1 mRNA扩增曲线为比较经典的S型(图 1)，大约在21 个循环后进入荧光信号指数扩增阶段， 大约扩增12 个循环以后进入平台期，从扩增曲线我们可以了解到，CCNB1的CT值平均为21左右，CCNB1 mRNA溶解曲线为一个单峰(图 2)，此单峰前后均未见其它的峰值，均可说明在实验过程中未见因实验操作不当可能引起的污染。

表 1 CCNB1 mRNA在OSCC中不同临床特征的相对表达量

Tab 1 The relative expression of CCNB1 mRNA in OSCC different clinical features

临床特征nCCNB1 mRNA相对表达量t值P值性别 男181.496 1±0.656 41.3420.187 女241.216 0±0.678 9年龄(岁) <60201.322 7±0.721 30.1210.905 ≥60221.348 2±0.648 8分化状态 高分化271.139 1±0.691 82.7250.009 中、低分化151.690 5±0.489 7临床分期 Ⅰ Ⅱ241.018 7±0.645 24.1500.000 Ⅲ Ⅳ181.759 1±0.455 0

注：P<0.05有统计学意义

图 1 CCNB1 RT-PCR扩增曲线

图 2 CCNB1 RT-PCR溶解曲线

3 讨 论

细胞周期蛋白首先在海胆受精卵中被发现，在Howard学说中，细胞周期的各个分期是以细胞核DNA的复制和分裂作为标准，分成G1期(合成前期)、S期(合成期)、G2期(合成后期)、M期(分裂期)，根据细胞形态，从细胞的G1～G2期均为细胞间期，细胞周期蛋白在有丝分裂的细胞间期开始进行合成，其含量在G2/M期含量达到峰值，随后含量逐渐减低直至下一轮细胞周期开始进行重复，不同类型的细胞周期蛋白与相对应的细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)互相作用，进而促进细胞的增殖与发展。

CCNB1是细胞周期蛋白(cyclin)家族成员之一，该基因的长度大约8 800 bp，其作用于真核细胞有丝分裂周期中的G2/M检测点，CCNB1是CDC2蛋白(cell division cycle 2)的伴侣分子，随着CCNB1的含量与活性的增高，CDC2也会随之增高，CCNB1与CDC2互相结合形成M期促进因子(M phase-promoting factor， MPF)，使细胞从细胞间期向M期进行转变并开始有丝分裂，进而促进真核细胞周期的发展[9]，当细胞进入分裂期中期以后，后期促进复合物(anaphase promoting complex，APC)将泛素与CCNB1相连接，这时蛋白酶体(proteasome)将发挥作用，对结合泛素的CCNB1进行识别然后对其进行降解，进一步使MPF失活[10]，当MPF失活以后也就意味着M期的结束，一个完整的细胞周期完成，当CCNB1表达失调时，例如本次研究结果所示，在OSCC中CCNB1的表达量增高，使细胞G2/M检测点受损以及导致MPF的增高，该检测点无法检测DNA是否损伤，这就会使受到损伤的DNA继续进行后续的有丝分裂，还会导致在分裂期的中期蛋白酶体无法分解和识别全部的MPF，从而导致肿瘤细胞的不断增殖与发展[11]，然而在正常细胞周期中，如果有损伤或者非正常的DNA，G2/M期的所合成的MPF活性和相对应的表达含量会受到抑制，使细胞进入有丝分裂期造成一定的阻碍作用，从而抑制了细胞的发展与增殖，相对应的就是CCNB1 mRNA的表达量相对较小，与本次的研究结果相一致。

本次实验研究结果表明，CCNB1 mRNA在OSCC中高表达，在性别和年龄的分组中，鳞状细胞癌组织中男性的CCNB1 mRNA的表达以及大于60 岁的年龄组虽然相比于女性和小于60 岁的年龄组有差异性，但是统计学无意义，说明CCNB1的表达量可能不受到由于年龄或性别原因导致体内激素等水平的改变而增加或减小表达量，然而在病理分级和临床分期分组来比较，统计学数据有意义，随着OSCC分化程度越低，CCNB1 mRNA的表达量就越高，OSCC的临床分期越晚，CCNB1 mRNA的表达量也会随之增高，这两组比较结果可能说明在OSCC细胞在发展过程中，CCNB1与鳞状细胞起到相辅相成的作用，使癌细胞进一步增殖和分化，同样更多的癌细胞又促使CCNB1的表达量进一步升高，其结果在对乳腺癌[12]、结肠癌[13]、垂体腺瘤[14]、肝癌[15]中CCNB1 mRNA呈高表达具有一致性。可以推测，在口腔鳞状细胞癌中，CCNB1的表达含量增高，与CDC2结合后形成MPF，导致肿瘤细胞内MPF过度累积以及基因检测点的受损，进一步促进了肿瘤细胞生成、增殖与分化，并且与肿瘤的恶性程度及临床分期有相辅相成的关系。

综上所述，CCNB1在OSCC中高表达，同时其表达量与分化状态和肿瘤细胞的临床分期及分化状态有一定的关系，提示在肿瘤细胞中恶性程度越高，临床分期越晚，其表达量越高，对于此次研究，未来有望通过调节CCNB1的表达量或从不同角度对该基因的靶向治疗来抑制肿瘤细胞的增殖，为口腔恶性肿瘤的靶向治疗提供一个良好的靶点，或者对于CCNB1的促进因素也同样可以用各种途径进行抑制，最终的目的都是尽可能的降低CCNB1的表达量促使降低MPF的形成，从分子水平对口腔恶性肿瘤及预后有一个参考标准。