邱厚匡， 李 博， 马 俊， 徐 敏， 王丽萍， 许 鸣

广东省第二人民医院 1.检验医学部； 2.消化科，广东 广州 510317； 3.佛山市第二人民医院消化科

我们前期实验发现，沉默miR-345的表达可引起胃癌细胞周期进程的停滞而减慢细胞生长速度[1]。进一步研究发现，沉默miR-345表达能抑制5-FU对MGC803细胞侵袭能力，且5-FU浓度为40 μg/ml时此协同作用最大[2]。因此本实验在前期研究成果的基础上，通过抑制胃癌MGC803细胞中miR-345的表达后，观察胃癌MGC803细胞在5-FU作用下增殖能力、细胞周期等变化情况，为我们成体系研究沉默miR-345表达增加5-FU对胃癌化疗敏感性寻求更多依据。

1 材料与方法

1.1 材料胃癌MGC803细胞购自南京凯基生物科技发展有限公司(产品批号：2016007100236.1)；Lipofectamine 2000及Trizol购自Invitrogen公司；Real time-PCR检测试剂盒购自Roche公司；miR-345的RT和Real time-PCR引物由Invitrigen公司设计、合成；碘化吡啶(PI)购自美国Sigma公司；细胞凋亡检测仪购自南京凯基公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：胃癌MGC803细胞培养于质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM培养基中，细胞融合度为70%～80%时，胰酶消化并传代1次。

1.2.2 实验分组与细胞处理：A组：空白对照组；B组：无义序列组；C组：反义miR-345组；D组：5-FU处理组；E组：反义miR-345+5-FU联合组。未经处理的MGC803细胞为空白对照组；合成错配寡核苷酸序列，利用Lipofectamine 2000脂质体将其转染入MGC803细胞为转染无义序列组；合成miR-345反义寡核苷酸序列，利用Lipofectamine 2000脂质体将其转染入MGC803细胞，为反义miR-345组；40 μg/ml 5-FU单独处理细胞为5-FU处理组；转染反义miR-345后用40 μg/ml 5-FU溶液处理为反义miR-345+5-FU联合组。

1.2.3 反义miR-345寡核苷酸设计合成及转染：从miRNAs靶基因库(http://microrna.sanger.ac.uk/targets/v3)获得miR-345基因序列，设计并合成甲基化miR-345反义序列：5′-UTCAATGTUGAATCCAGCAUAAGCUAGAGUCC-3′，无义序列：5′-UCUACUCUUAGGAGGUUGUUGATGCA-3′。……