项伟玲，金丽琴△，高 峰，肖 敏，陈 燕

(1.温州医科大学检验医学院生命科学学院，浙江 温州 325035；2.浙江省人民医院针灸推拿科,杭州 310014)

2型糖尿病临床上常伴有肥胖症、血脂异常、高血压等。由于血液中的糖分升高，患者更容易发生急性严重代谢紊乱、感染性疾病、慢性并发症如微血管病变、大血管病变、神经系统并发症、糖尿病足等并发症。长期控制血糖水平在正常范围是阻止和延缓上述并发症等重要途径。胰岛素敏感性降低即胰岛素抵抗是2型糖尿病发病机制度重要环节。胰岛素敏感组织的葡萄糖摄取量减少和胰岛β细胞功能降低是2型糖尿病的特征性病理生理学改变。现代药理研究表明，普通苦荞麦具有降血糖、降血脂、清除自由基抗氧化等功能[1-2]，对心脑血管系统疾病具有辅助治疗的作用[3]。黑苦荞茎叶的主要成分是黄酮，有研究表明[4-5]，苦荞黄酮具有降低血糖、维持血管抵抗力、抗自由基等功能，其降血糖机制可能与促进胰岛素的分泌、提高胰岛素与其受体亲和力等有关，提高机体组织对胰岛素的敏感性，近几年，有相关实验表明当年生成熟的黑苦荞茎叶为材料提取活性物质，对以四氧嘧啶所致的高血糖小鼠进行降血糖研究，发现其对四氧嘧啶所致的高血糖小鼠具有较好的降血糖功能[6]。目前，国内外专家学者对黑苦荞茎叶对2型糖尿病的治疗及其对胰脏、脾脏的影响的尚未明确。脾脏是机体重要的免疫器官，持续高血糖会损坏器官组织，导致免疫系统失调[7]，本实验在前期研究的基础上，研究当年生成熟的黑苦荞茎叶为材料，对链脲佐菌素所致高血糖小鼠进行降血糖功能以及其对胰脏、脾脏的影响进行研究，以其为黑苦荞茎叶在临床的进一步应用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57/B16小鼠40只，周龄8～9周，购自上海斯莱克试验动物责任有限公司。

1.2 实验仪器

WETRUST康麟血糖仪(讯映光电有限公司)，全自动生化分析仪(日本日立公司)，CT15RE型台式微量高速离心机(日本日立公司)，NanDrop2000核酸蛋白分析仪(Thermo)，S1000TM Thermal Cycler梯度PCR仪(Bio-Rad)，CFX Connect TM荧光定量PCR检测仪(Bio-Rad)。

1.3 实验试剂

黑苦荞茎叶(购自西安利时生物科技有限公司)，链脲佐菌素(购自台州艾明康生物有限公司)，蛋白裂解液RIPA(碧云天)，逆转录试剂盒(诺维赞)，Trizol(invitrogen)，SYBR Green(Bio-Rad)，SYBR Premix Ex Taq II(Takara)，Insulin and actin Primers(上海生工设计)，小鼠IRS-1、INSR、TNF-α的ELISA试剂盒(购自上海源叶生物科技有限公司)PVDF膜(Millipore Corp，USA)，一抗稀释液(Beyotime，China),ECL-化学发光试剂盒(ECL-plus，ThermoScientific)。

1.4 小鼠模型建立及分组

40只SPF级雄性C57/BL6小鼠，经适应性喂养1周后随机分为正常对照组(NC)10只和实验组30只，NC组喂养普通饲料，实验组喂养高糖高脂饲料(常规饲料66.5%+20%红糖+10%猪油+2.5%胆固醇+1%胆酸盐)。喂养35 d后，将小鼠禁食6 h后，使用腹腔注射法注射40 mg/kg链脲佐菌素(STZ,临用前用 0.1 mol/L 柠檬酸钠缓冲液配成 1%、pH 4.2 的溶液)，72 h后禁食6 h，断尾取血测空腹血糖(fasting blood glucose，FPG)，FBG大于11.6mmol/L)且小鼠出现三多(多饮、多食、多尿)症状，则成功构建糖尿病小鼠模型。NC组腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。建模成功后将模型小鼠随机分为3组：模型对照(DM)组、低剂量黑苦荞茎叶治疗(DM+L)组、高剂量黑苦荞茎叶治疗(DM+H)组。

1.5 干预及标本采集

使用生理盐水溶解黑苦荞茎叶(浓度为 0.04 g/ml)，DM+L组小鼠灌胃0.21g/kg·d-1黑苦荞茎叶，DM+H组小鼠灌胃0.42g/kg·d-1黑苦荞茎叶[6]，NC、DM组则灌胃等量生理盐水。14 d后，将小鼠禁食6 h，称量小鼠体重，断尾取血测量空腹血糖(FBG)，摘眼球取血0.6 ml血样，离心后取上清于干净的离心管中，分别检测空腹血清葡萄糖(FBG)、TG、TCH。取各组胰脏、脾脏标本并编号。用电子天平称量小鼠脾脏质量，计算脾脏系数=脾脏质量(mg)/体重(g)。部分胰腺组织组织使用4%多聚甲醛固定用于组织包埋，部分组织液氮速冻后保存于-80℃冰箱冷冻保存。

1.6 各组小鼠血清中INS和脾脏组织TNF-α蛋白含量的测定

使用ELISA试剂盒检测小鼠血胰岛素含量(insulin,INS)和脾脏组织TNF-α蛋白含量。

1.7 胰脏组织的病理学观察

取各组胰腺标本放入对应编号的包埋盒并编号，部分组织使用4%多聚甲醛固定的胰腺标本24～48 h，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，切成4 μm切片，将切片后的胰脏组织进行HE染色，镜下观察并拍照各组胰脏组织形态变化。

1.8 胰岛素受体底物IRS-1蛋白的表达

通过含有苯甲基磺酰氟的RIPA裂解缓冲液裂解小鼠胰腺组织，使用增强的BCA蛋白质测定试剂盒测量蛋白质浓度。分离等量的蛋白质并通过SDS-PAGE凝胶电泳并转移到PVDF膜上。5% BSA封闭,一抗(1∶1 000 稀释)4℃ 过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000 稀释)室温孵育2 h，用ECL-化学发光试剂盒使蛋白质条带显影。

1.9 胰腺组织IRS-1 mRNA表达量测定

采用Trizol一步法提取小鼠胰腺组织总RNA，逆转录合成cDNA，操作严格遵照试剂盒说明书，用实时荧光定量PCR测定IRS-1 mRNA表达量，以β-actin为内参。IRS-1 mRNA 上游引物序列 5’- CGATGGCTTCTCAGACGTG-3’；IRS-1 mRNA 下游引物序列 5’- CAGCCCGCTTGTTGATGTTG-3’。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 四组小鼠生化指标比较

与NC组比较，DM组空腹血清FBG、TG、TCH含量均升高,胰岛素均降低(P<0.05，表1)；与DM组比较，DM+L组、DM+H组FBG、TG、TCH均下降，胰岛素含量均升高(P<0.05)，与DM + L 组相比，DM + H 组小鼠FBG、TG、TCH下降无显著差异(P>0.05,表1)。

Tab. 1 Comparison of biochemical indicators among the four groups n=10)

NC:Normal control;DM:Diabetes model control;DM+H:Diabetes model control with high black tartary buckwheat;DM+L:Diabetes model control with low black tartary buckwheat;FBG:Fasting blood glucose;TG:Triglycerides;TC:Total cholesterol
*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group

2.2 四组小鼠胰腺组织病理学检查

胰腺组织切片镜下观察：正常对照组胰岛为圆形、椭圆形细胞团，边界清除，胰岛数及胰岛内细胞数较多，胰岛内分泌细胞大小一致，胞质丰富，核染色质清晰；模型对照组胰岛内分泌细胞排列稀疏不均，大部分细胞核淡染，少数细胞呈空泡状；高剂量组胰岛数及胰岛内细胞数明显增多，细胞分布不均匀，核大小基本相等，无核固缩；低剂量组胰岛内细胞数增多形态较为规则，结构基本正常，胞浆均匀无空泡，核仁较清晰，细胞排列较均匀，少部分核固缩(图1)。

Fig.1Comparisons of hematoxylin-eosin(HE)staining on pancreas tissues in four groups(×200)

2.3 四组胰腺组织IRS-1 mRNA表达比较

与NC组比较，DM组、DM+H组、DM+L组小鼠胰腺IRS-1 mRNA 表达均降低(P<0.05)；与DM组比较，DM+L组、DM+H组小鼠胰腺IRS-1 mRNA表达升高(P<0.05)，与DM+L组相比，、DM+H组IRS-1 mRNA表达无显著性差异(P>0.05,图2)。

Fig.2Comparison of IRS-1 mRNA expression in the tissues among four groups
NC:Normal control;DM:Diabetes model control;DM+H:Diabetes model control with high black tartary buckwheat;DM+L:Diabetes model control with low black tartary buckwheat;IRS-1:Insulin receptor substrate-1
*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group

2.4 四组小鼠胰腺组织中胰岛素受体底物IRS-1蛋白表达的检测

与NC组比较，DM组小鼠胰腺组织中IRS-1的蛋白水平均降低(P<0.05);与DM组比较，DM+H组、DM+L组小鼠胰腺组织中的IRS-1的蛋白表达水平升高，其差异均有统计学意义(P<0.05),与DM+L组相比，DM+H组IRS-1蛋白表达无显著性差异(P>0.05，图3)。

Fig.3The comparison of IRS-1 expression in the pancreas tissues among four groups
NC:Normal control;DM:Diabetes model control;DM+H:Diabetes model control with high black tartary buckwheat;DM+L:Diabetes model control with low black tartary buckwheat;IRS-1:Insulin receptor substrate-1
*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group

2.5 四组小鼠脾脏TNF-α和脾脏系数的检测

与NC相比，DM组、DM+H组、DM+L组小鼠TNF-α升高、脾脏系数明显降低(P<0.05，表2)；与DM组相比，DM+H组、DM+L组小鼠的TNF-α平均值明显降低，脾脏系数明显升高，其差异均有统计学意义(P<0.05)，与DM+L组相比，、DM+H组脾脏TNF-α和脾脏系数无显著性差异(P>0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of TNF-α level in spleen tissue and spleen coefficient among the four groups n=10)

NC:Normal control;DM:Diabetes model control;DM+H:Diabetes model control with high black tartary buckwheat;DM+L:Diabetes model control with low black tartary buckwheat;TNF-α:Tumor necrosis factor α
*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group

3 讨论

2型糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，是世界的常见病、多发病，是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。有研究发现，黑苦荞茎叶中含有丰富的亚油酸、芦丁、槲皮素、微量元素、维生素、植物固醇等[8]。氧化应激在糖尿病的慢性复杂病变中扮演着重要角色，随着研究进一步深入，发现氧化应激水平的升高与胰岛素抵抗的发生密切相关[9,10]。大量的证据以及显示具有强抗氧化性质的混合物发挥有益的作用来对抗高糖、胰岛素抵抗和氧化应激[11-12]，这被认为是一个可以阻止糖尿病发生和/或者治疗糖尿病的有效途径[13-14]。黑苦荞茎叶的主要成分是黄酮类物质，主要是芦丁和槲皮素类[8]，已被证实可以通过保护胰腺β细胞的完整性，重建肝脏的抗氧化状态，增加葡萄糖转移酶4转移[15-17]，从而降低血清血糖。槲皮素，也已经被证实可以在糖尿病机体中通过抑制肝脏血糖产生，增加葡萄糖吸收，加强胰岛素分泌，通过ERK1/2路径保护胰腺β细胞INS-1对抗氧化应激而发挥降糖的作用[18]。

本实验选取用高糖高脂饲料喂养诱导并注射链脲佐菌素(STZ)所构造的2型糖尿病小鼠模型作为研究对象，给予黑苦荞茎叶灌胃治疗，通过观察2型糖尿病小鼠血清生化指标、胰腺病理形态改变、脾脏系数计算、TNF-α蛋白表达、胰岛素受体底物IRS-1蛋白表达以及胰腺IRS-1 mRNA表达情况探讨黑苦荞茎叶对2型糖尿病小鼠胰腺机理的治疗作用。用药干预后，镜下观察胰腺组织病理学切片，可见BBL治疗组小鼠组织基本紧密、饱满，胰岛体积略小，与DM组相比胰腺组织明显恢复，更接近正常胰岛细胞。血清生化指标及ELISA结果提示，与DM组相比，BBL治疗组的血糖、血脂明显降低，胰岛素水平明显升高。与DM小鼠比较，BBL治疗组小鼠IRS-1 mRNA的表达量明显上升，IRS-1蛋白表达水平明显升高。上述结果提示口服黑苦荞茎叶可通过上调IRS-1 mRNA和IRS-1蛋白表达水平来增强胰岛素作用，对修复和维持糖尿病小鼠胰腺β细胞正常功能有一定作用，黑苦荞茎叶可以一定程度上修复部分胰岛功能，提高血清胰岛素浓度，来降低血糖，改善血脂质谱。脾脏是机体重要的免疫器官，持续高血糖会损坏器官组织，导致免疫系统失调[7]。由表2数据可知，DM组的脾脏系数明显低于正常对照组(P<0.05)，可见脾脏系统明显萎缩，免疫功能可能已受到影响。DM+H组和DM+L组的脾脏系数均高于糖尿病组(P>0.05),说明BBL对脾脏具有保护作用，并且通过保护脾脏来调节机体自身免疫功能，进而抵御氧化应激对胰岛β 细胞的损伤。研究表明，长期吃高脂肪食物会导致肠道菌群失调，尤其是肠道中革兰阴性菌增加，其细胞壁结构中的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)释放，产生大量内毒素，破坏肠道黏膜，造成肠壁渗漏，并可吸收入血，进一步刺激免疫细胞分泌炎症因子如TNF-α,以炎症因子升高为特征的慢性低度炎症与代谢异常密切相关，最终可引起2型糖尿病胰岛素抵抗[19，20]。在本研究中，DM组的TNF-α明显高于CN组(P<0.05),可见模型组小鼠机体内的慢性炎症更加严重，而经过BBL治疗的DM+H组和DM+L组的TNF-α明显降低，说明BBL具有降低炎症，改善代谢异常的作用。

综上所述，本研究观察了黑苦荞茎叶对2型糖尿病模型小鼠的治疗作用，通过病理学观察、血生化指标观察和胰腺相关指标的观察，证明黑苦荞茎叶可以降低血糖、改善脂质、促进胰岛素分泌、提高胰岛素敏感性、增强机体的免疫功能，对糖尿病小鼠的胰腺、脾脏有一定的保护作用，对于未来糖尿病的预防和治疗，将会有一定的临床应用价值。