徐菲菲，缪成锋，池 琛，吴 谷，陈国荣

(温州医科大学附属第一医院病理科，浙江 温州 325015)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种由于胰岛素分泌不足或者胰岛素抵抗引起的内分泌疾病，它可以引发全身多个器官及组织的并发症。生殖功能障碍作为糖尿病的一种并发症，包括了阳痿、射精不全、不孕等[1,2]。有研究表明，氧化应激在糖尿病男性和动物模型的生殖功能异常中发挥重要作用；核因子E2相关因子2(the nuclear factor-erythroid-2 related factor 2，tNrf2)作为一个对抗氧化应激的防御因子，它可以通过上调抗氧化蛋白的表达来对细胞产生保护[3]，而糖尿病大鼠睾丸氧化应激损伤与Nrf2的下调息息相关[4,5]。

姜黄素是从姜黄根茎中分离出来的具有活性的黄色二酮类化合物，分子式为C21H20O6。姜黄素已被证实具有治疗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用；同时，在中国及印度等国家，它也得到广泛的临床应用，并取得较好的治疗效果[6]。此前，有学者提出姜黄素可通过上调Nrf2及其下游因子的表达来对抗糖尿病大鼠睾丸病变[7]，本实验室在前期实验中也证明了姜黄素类似物B06对于糖尿病大鼠发生在心肌[8]，肾脏[9]，睾丸[10]的病变均有一定的治疗效果。本次实验，使用B06基础上改良而来的姜黄素类似物J7，将姜黄素结构中不稳定的β-二酮替换为单酮，其药物稳定性及生物利用度上均得到一定程度的改良。并进一步优化实验设计及分组，通过建立糖尿病大鼠模型，研究姜黄素类似物J7与姜黄素对糖尿病大鼠睾丸病变的干预作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠60只(200±20)g，由温州医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(浙)2015-0009。大鼠饲养室内温度18～24℃，相对湿度45%～55%。

1.2 药品与试剂

姜黄素采购自美国Sigma公司，姜黄素类似物J7(图1)由温州医科大学药学院合成提供，两种药物均溶于1%羧甲基纤维素钠(CMCNa)溶液；Western blot及免疫组化所使用的抗体包括β-actin、磷酸化核因子E2相关因子2(phosphorylation of Nrf2，pNrf2)、tNrf2、过氧化氢酶(catalase，CAT)、NAD(P)H 醌氧化还原酶1(NAD(P)H quinine oxidoreductase 1，NQO1)均购自于美国Abcam公司；逆转录及实时荧光定量PCR试剂盒均购自于日本Takara公司；Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)相关引物由上海生工合成；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。

Fig. 1 The chemical formula of J7

1.3 主要仪器

血糖测试仪(美国强生公司)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)，QuantStudio 5 Real-Time PCR系统(美国Thermo公司)，RM2245型石蜡切片机(德国莱卡公司)，BX 43型显微成像系统(日本Olympus公司)，全自动酶标仪(西班牙Diagnostic Grifo公司)，Image Lab图像分析软件(美国Bio-Rad公司)。

1.4 动物模型建立

60只健康SD大鼠适应性饲养一周后，测量体重及血糖情况均正常，且无明显差异，后随机分组，其中10只作为正常组(normal control，NC组)，剩余50只作为实验组。正常组正常饮食4周，实验组高脂饮食4周。4周后，高脂饮食的大鼠腹腔注射链脲佐菌素(steptozotocin，STZ)30 mg/kg进行糖尿病建模，72 h后及一周后检测大鼠尾静脉空腹血糖，两次均大于16.7 mmol/L的认为造模成功。测定结果为50只实验组大鼠中，42只建模成功，8只建模失败予以剔除。然后将成功建模的大鼠，随机分为4个实验组：糖尿病组(DM组)、姜黄素治疗组(curcumin，CUR组)、J7高剂量治疗组(J+ 组)、J7低剂量治疗组(J- 组)。将姜黄素及姜黄素类似物J7分别溶于1%羧甲基纤维素钠(CMCNa)溶液，在接下来的8周中，CUR组大鼠每天予以姜黄素20 mg/kg灌胃治疗，J+及J-组分别予以J7 20 mg/kg、10 mg/kg灌胃治疗，NC组及DM组予以相同体积的1%CMCNa溶液灌胃。在实验过程中，8只大鼠死亡予以剔除，实验结束时，每组大鼠数目分别为NC 组(n=9)、DM 组(n=10)、CUR 组(n=7)、J+ 组(n=8)、J- 组(n=10)。8周后，测量过所有大鼠的血糖及体重后，予以腹腔麻醉后并处死，并对所需标本进行及时的收集与处理。

1.5 HE染色及免疫组织化学法

将大鼠睾丸组织用Bouin’s液固定后，脱水，透明，浸蜡，包埋制成蜡块，使用切片机对蜡块进行切片(3.5 μm)。根据试剂说明书，对处理好的切片分别进行HE染色及Nrf2、CAT指标的免疫组化处理。最后，利用显微镜对图像进行观察及采集。

1.6 蛋白质印迹法(Western blot)

将新鲜大鼠睾丸组织进行充分裂解及研磨后，使用BCA法测定不同组间蛋白浓度，并将等量蛋白样本进行煮沸及分装。然后，进行制胶，上样，电泳，转膜，孵育，曝光，获得Western blot最终条带。使用Image Lab软件对各条带进行定量分析。

1.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

将新鲜大鼠睾丸组织进行研磨，提取RNA后，使用酶标仪测定不同组间RNA的纯度及浓度，并将等量RNA进行逆转录反应获得cDNA。然后，根据试剂盒说明书，利用cDNA样本进行qRT-PCR反应并分析。

1.8 SOD及MDA测定

根据试剂盒说明书，分别对不同组间睾丸的超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量进行测定。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 不同组大鼠血糖及体重的比较

如表1所示，在实验结束时，糖尿病大鼠血糖(29.26±4.67)mmol/L明显高于正常组(5.82± 1.19)mmol/L，其中J+组及J-组血糖显著下降(P<0.05)，而CUR组大鼠血糖下降并不明显。同时，糖尿病大鼠体重(287.00±56.18)g相对于健康大鼠(407.80±46.04)g也出现了显著的降低(P<0.05)，通过姜黄素及J7治疗后，三个治疗组体重未发生明显改变。

Tab. 1 Effects of curcumin and J7 on fast blood glucose and body

NC：Normal control；DM：Diabetes mellitus；CUR：Curcumin-treated diabetes mellitus；J+：High dose of J7；J-:Low dose of J7
*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group

2.2 不同组大鼠睾丸形态学改变的比较

如图2所示，HE染色结果中，正常组睾丸曲细精管形态完整，生精细胞5～8层，排列整齐，规则的管腔内可见发育成熟的精子。在糖尿病组中，曲细精管内各级生精细胞出现不同程度缺失，层数减少，排列紊乱，管腔发生闭塞，精子成熟出现障碍。经过姜黄素及J7治疗后，上述形态学的病变得到不同程度的改善，但三个治疗组间差异不明显(图2)。

在Nrf2的免疫组化结果中，正常组曲细精管内可见该蛋白在各级生精细胞中有较为明显的核周阳性表达，糖尿病组核周染色相对较浅，通过姜黄素及J7治疗后，糖尿病睾丸核周的Nrf2出现上升，但三个治疗组间差异不明显。而在CAT的免疫组化结果中，发现在睾丸Leydig细胞内，糖尿病组CAT的阳性表达程度明显低于正常组，经过姜黄素及J7治疗后，CAT在Leydig细胞中的表达量得到提升，但三个治疗组间差异不明显。

2.3 不同组大鼠睾丸pNrf2、tNrf2、NQO1、CAT蛋白的表达

如图3及表2所示，各组间的tNrf2并没有出现显著差异。但是，pNrf2/tNrf2值在糖尿病组出现下降(P<0.05)，经过姜黄素及J7治疗后，该比值得到了显著的回升(P<0.05)。此外，J+组pNrf2/tNrf2比值明显高于CUR组及J-组(P<0.05)。同时，糖尿病组比起正常组，NQO1及CAT蛋白的表达量也更低(P<0.05)，姜黄素及J7同样可以减轻这两个指标的变化(P<0.05)，其中J+组CAT蛋白水平明显高于J-组(P<0.05)。

Fig.3Protein expressions of pNrf2,tNrf2,NQO1 and CAT in the testis

Tab. 2 Curcumin and J7 induced the protein expressions of tNrf2,pNrf2/tNrf2,NQO1,CAT in the

NC：Normal control；DM：Diabetes mellitus；CUR：Curcumin-treated diabetes mellitus；J+：High dose of J7；J-:Low dose of J7
*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group；△P<0.05vsCUR group；▲P<0.05vsJ- group

2.4 不同组大鼠睾丸NQO1、Hemeoxygenase-1(HO1)、CAT mRNA表达水平的比较

如表3所示，在糖尿病大鼠的睾丸组织中，NQO1、HO1、CAT mRNA出现不同程度的下降(P<0.05)。通过姜黄素及J7治疗后，三个治疗组NQO1和HO1 mRNA的下降均得到缓解(P<0.05)；而CAT mRNA的改变只在J+组得到显著的恢复(P<0.05)。同时，NQO1、HO1、CAT mRNA在三个治疗组间不存在显著差异。

Tab. 3 Curcumin and J7 induced Nrf2 transcription function in the

NC：Normal control；DM：Diabetes mellitus；CUR：Curcumin-treated diabetes mellitus；J+：High dose of J7；J-:Low dose of J7
*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group

2.5 不同组大鼠睾丸超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量的改变

如表4所示，与正常组相比，糖尿病大鼠的睾丸组织中，SOD活性明显下降(P<0.05)，而MDA的含量出现上升(P<0.05)。在三个治疗组中，这两个指标的异常变化均得到不同程度的改善(P<0.05)。但SOD活性及MDA含量在三个治疗组间不存在显著差异。

Tab. 4 Effects of curcumin and J7 on antioxidant ability in the

NC：Normal control；DM：Diabetes mellitus；CUR：Curcumin-treated diabetes mellitus；J+：High dose of J7；J-:Low dose of J7
*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group

3 讨论

近年来世界各地的糖尿病患者数量急剧增加，据统计，2013年全球已有3.82亿的糖尿病患者，到2035年预计这个数字将会增加到5.92亿，其严重的并发症会给患者的身心健康和生活质量带来巨大的危害[11]。睾丸组织正常的结构和功能是维持生殖能力的基本条件，本实验观察到糖尿病大鼠睾丸曲细精管结构受到严重破坏，而姜黄素及其类似物J7对糖尿病大鼠的睾丸组织结构则具有一定的保护作用。

国内外均有研究表明高血糖导致的生殖系统损伤可能与过度激活的氧化应激反应有关[12]。在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠中，姜黄素已经被证明可以通过缓解氧化应激，从而减轻睾丸组织的损伤和细胞凋亡[13]。并且有学者发现姜黄素可以通过上调Nrf2及其下游抗氧化因子表达来减轻糖尿病大鼠睾丸的病变[7]。在正常生理条件下，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1)相互结合，主要以复合物的形式存在于细胞质中，当机体发生氧化应激时，Nrf2 Ser40位点发生磷酸化使Nrf2-Keap1复合物解离，游离的Nrf2转移至细胞核与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合，激活Nrf2-ARE信号通路并上调下游抗氧化因子的表达[6,14,15]；近几年的研究中，Nrf2已成为多种疾病的新兴治疗靶点，如神经退行性疾病、癌症、肺纤维化等[16]。本实验室已证实姜黄素类似物B06对于糖尿病大鼠睾酮的合成也存在影响作用[10]。但这些实验中治疗组往往比较单一，未进行不同药物或不同药物剂量的比较分析。本研究在前人的基础上，提出全新的姜黄素类似物J7，并优化分组设计，共包含3个治疗组，能更好地说明J7所具备的治疗优势及其理想的治疗剂量。本研究发现姜黄素及其类似物J7可通过上调Nrf2及其下游抗氧化因子提高糖尿病睾丸的抗氧化能力。此外，通过检测SOD活性和脂质过氧化产物MDA含量，也证实睾丸存在严重的氧化应激，而姜黄素及其类似物J7对糖尿病大鼠睾丸氧化应激具有抑制作用。

相关文献表明，姜黄素药理作用广泛，同时具有安全性高，毒性小的优点[17,18]。但姜黄素的β-二酮基结构会导致其不稳定及生物利用度不高[19]。而姜黄素类似物J7作为一种经过改良的单羧基姜黄素类似物，其稳定性及生物利用度上均得到一定提升。本实验发现，J+组pNrf2/tNrf2水平显著高于CUR组及J-组，CAT蛋白水平显著高于J-组，且差异均具有统计学意义，提示高剂量J7抗糖尿病大鼠睾丸的氧化应激损伤的能力较强。

综上所述，在糖尿病睾丸组织中，相较于传统药物姜黄素，J7的疗效有优于姜黄素的趋势，它能有效保护睾丸组织结构；并更有效地激活Nrf2-ARE信号通路来降低氧化应激损伤。而这也为治疗糖尿病睾丸相关病变，及预防它的发生发展提供一个新方案。