李小燕，谢永红，杨丽

(广州军区广州总医院一五七分院，广州 510510)

宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌。据统计，全球每年约有53万宫颈癌新发病例[1]。人乳头瘤病毒(HPV)感染是诱发宫颈癌的首要危险因素。此外，吸烟、多孕多产等亦是导致宫颈癌发生的重要危险因素[2]。手术、放疗和化疗是宫颈癌的一线治疗方案。目前临床仍缺乏特异度、灵敏度较高的宫颈癌靶标。微小RNA(miRNAs)是由21～25核苷酸组成的非编码RNA，可在转录后调节基因表达。目前已证实，miRNAs在细胞的各种生理过程中均发挥作用，且miRNAs异常表达可导致疾病发生，包括恶性肿瘤[3]。根据miRNAs靶基因的功能，miRNAs可同时兼具促癌基因和抑癌基因功能。miR-196a被证实可促进胃癌[4]、肝癌[5]和子宫内膜癌[6]等恶性肿瘤形成，同时胰腺癌患者血清miR-196a表达增加，且血清miR-196a表达与临床分期和生存时间相关[7]。Liu等[8]发现，宫颈癌组织中miR-196a表达增加，而宫颈癌患者血清中miR-196a表达表达是否增加目前尚不清楚。

2014年1～12月，我们检测了宫颈癌患者血清miR-196a表达，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年1～12月入住我院的宫颈癌患者80例，纳入标准：①具备完整病历资料；②病理诊断证实为宫颈癌；③术前未接受放化疗等抗肿瘤治疗。排除标准：①合并其他妇科疾病；②合并其他恶性肿瘤；③合并肝肾等重要器官功能不全；④年龄>70岁；⑤失访病例。80例宫颈癌患者年龄25～70(50.12±6.32)岁，其中≤50岁者46例，>50岁者34例。肿瘤直径：≤4 cm者51例，>4 cm者29例。病理分级：G1级28例，G2级24例，G3级28例。淋巴结转移：无淋巴结转移者49例，有淋巴结转移者31例。HPV感染：无HPV感染4例，有HPV感染76例。国际妇产科联盟(FIGO)分期：Ⅰ期56例，Ⅱ期24例。以确诊时间为起点，以门诊、电子通讯的方式，对宫颈癌患者进行随访调查，直至患者死亡或随访时间结束(2018年9月)。同期选取于我院体检的80例女性健康志愿者作为对照，年龄24～68(50.64±7.04)岁。宫颈癌患者与健康对照者年龄比较无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。本研究获得我院伦理委员会审核批准。研究对象均签署知情同意书。

1.2 血清miR-196a表达检测 抽取所有研究对象(宫颈癌患者术前，健康志愿者体检时)晨起空腹外周静脉血5 mL，4 ℃、2 000 r/min离心5 min，收集上层血清，置于-80 ℃冰箱保存备用。严格参照血清miRNA提取试剂盒miRVanTMPARISTMkit(美国Ambion公司)说明书操作，加入 TRIzol试剂1 mL，室温静置5 min裂解细胞。加入氯仿，剧烈摇晃10 s后，室温静置5 min；15 000 r/min，4 ℃低温离心15 min，取上清，与等体积异丙醇混匀，室温静置10 min； 4 ℃、15 000 r/min离心15 min，弃上清，加乙醇洗涤， 4 ℃、15 000 r/min离心15 min，弃上清，即可得RNA沉淀；加入适量DEPC水溶解，采用微量紫外分光光度计(NanoDrop2000，美国Thermo公司)检测RNA浓度和纯度[光密度(OD)260/OD280值为1.8～2.0)]。采用TaqMan®miRNA reverse transcription kit(美国ABI公司)进行反转录，严格参照试剂盒说明进行操作，产物cDNA置于-20 ℃冰箱保存备用。采用TaqMan microRNA检测试剂盒(美国ABI公司)检测血清miR-196a表达，反应体系为10 μL。反应条件：94 ℃预热10 min，95 ℃15 s、60 ℃1 min，共40个循环。miR-196a正向引物：5′-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3′，反向引物：5′-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6为内参，2-ΔΔCT法计算miR-196a的相对表达量，其中CT=宫颈癌患者(CTmiR-196a-CTU6)-健康志愿者(CTmiR-196a-CTU6)，每个样本进行3次独立重复实验后，对所得数据进行统计分析。以上指标检测由第三方检测机构广东金域医学检验中心操作。

2 结果

2.1 宫颈癌患者与健康志愿者血清miR-196a表达比较 宫颈癌患者、健康志愿者血清miR-196a相对表达量分别为3.17±1.63、0.95±0.21，两者比较差异有统计学意义(t=12.082，P=0.000)。

2.2 血清miR-196a表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系 宫颈癌患者血清miR-196a表达与患者年龄、肿瘤病理分级、HPV感染无关(P均>0.05)；宫颈癌患者血清miR-196a表达与患者肿瘤直径、有无淋巴结转移和FIGO分期有关(P均<0.05)，即肿瘤直径>4 cm、有淋巴结转移、FIGO分期为Ⅱ期的患者血清miR-196a表达高于肿瘤直径≤4 cm、无淋巴结转移、FIGO分期为Ⅰ期的患者(P均<0.05)，见表1。

表1 宫颈癌患者血清miR-196a表达与临床病理特征的关系

2.3 血清miR-196a表达与宫颈癌患者预后的关系 以血清miR-196a相对表达量的平均值为界限，将宫颈癌患者分为miR-196a高表达组(>平均值)42例和miR-196a低表达组(≤平均值)38例。建立生存率分析的Kaplan-Meier乘积极限模型(图1)。结果显示，miR-196a高表达组中位生存时间为26.2个月，3年生存率为38.10%(16/42)。miR-196a低表达组中位生存时间为38.3个月，3年生存率为71.05%(27/38)，均优于miR-196a高表达组。经Log-Rank检验，两组3年生存率比较差异有统计学意义(χ2= 5.082，P=0.024)。

图1 宫颈癌患者Kaplan-Meier生存曲线

2.4 血清miR-196a表达对宫颈癌的诊断价值 将血清miR-196a相对表达量划分为若干组段，建立ROC曲线分析模型。取约登指数(灵敏度+特异度-1)最大点为最佳临界值/理论阈值。结果显示，约登指数最大点为0.597，理论阈值点(血清miR-196a相对表达量)为1.37，对应的灵敏度为0.832，特异度为0.765，ROC曲线下面积(AUC)为0.853，见图2。

图2 血清miR-196a诊断宫颈癌的ROC曲线

3 讨论

miRNAs表达异常与肿瘤形成和恶性进展密切相关。因此，与肿瘤临床病理特征和患者预后相关的miRNAs分子具有作为肿瘤靶标的价值。目前，miR-196家族共发现miR-196a-1、miR-196a-2和miR-196b三个成员，其中miR-196a基因定位于HOX基因簇中[9，10]，miR-196a异常表达在肿瘤形成中发挥重要作用。miR-196a参与了肿瘤发生、细胞分化、免疫应答、炎症反应和病毒防御等多个重要生理过程[6，11]。研究[12]发现，联合检测血清miR-196a和miR-196b有助于舌癌的早期诊断。Zhang等[13]发现，骨肉瘤患者的血清miR-196a和miR-196b表达升高，且可作为预测患者不良预后的靶标。此外，血清miR-196a和miR-196b可作为侵袭性胃癌的新靶标。本研究之前，我们以miRNA芯片杂交检测法筛选了体外宫颈癌细胞系的miRNA表达谱，发现miR-196a存在高度表达异常，因此推测miR-196a对于宫颈癌可能存在诊断价值。

本研究结果显示，宫颈癌患者血清miR-196a表达高于健康志愿者,差异有统计学意义。多项研究证实，miR-196a在宫颈癌组织、宫颈癌细胞中均表达增加[8, 14]。由此推测，miR-196a可能参与并促进了宫颈上皮癌变过程，具有促癌基因功能。本研究发现，肿瘤直径>4 cm患者的血清miR-196a表达高于肿瘤直径≤4 cm患者，提示miR-196a可促进宫颈癌细胞增殖。Hou等[15]发现，miR-196a可通过调节FOXO1和p27Kip1基因表达，促进宫颈癌细胞增殖；Zhang等[16]在宫颈癌细胞中增加miR-196a表达可促进细胞增殖，并通过降低NTN4基因表达实现。一个miRNAs分子可靶向多个基因表达进而发挥生物学活性，后续研究中我们将寻找miR-196a可能靶向的其他与肿瘤增殖相关的基因，进一步阐述miR-196a调控宫颈癌细胞增殖的具体机制。此外，本研究发现，有淋巴结转移者血清miR-196a表达较高，提示miR-196a可能促进了宫颈癌细胞的淋巴结转移。Tsai等[17]在胃癌细胞中的研究发现，miR-196a可下调Radixin基因表达进而促进细胞侵袭，且在食管鳞状细胞癌中，miR-196a可通过调节RAP1A基因表达促进细胞侵袭[18]。参与调控肿瘤细胞侵袭迁移的基因甚多，后续我们将在体外细胞水平继续寻找miR-196a靶基因，尤其是与肿瘤侵袭迁移相关的靶基因。本研究结果显示，FIGO分期较高的宫颈癌患者血清miR-196a表达较高，提示监测宫颈癌患者血清miR-196a表达有助于评估患者病情进展，从而根据患者病情进展及早给予相应治疗，以有效提高患者生存率并改善患者的预后。本研究发现，血清miR-196a表达较高患者的3年总生存率较低、中位生存时间较短，患者预后较差.由此推测，宫颈癌患者血清miR-196a表达是宫颈癌患者预后的负性调控因子，与患者不良预后关系紧密，监测宫颈癌患者血清miR-196a表达有助于对患者预后进行初步判断。而Yang等[19]发现，当miR-196a表达受抑制时，宫颈癌细胞的增殖与侵袭均受到抑制，提示监控miR-196a表达可用于评估宫颈癌的恶性程度，有助于临床及时调整治疗方案，从而改善患者预后。血液检查具有方便、简单等特性，在肿瘤诊断方面具有较高的应用前景。本研究采用ROC曲线检验血清miR-196a表达对宫颈癌患者诊断的价值，结果显示，血清miR-196a表达对宫颈癌诊断的灵敏度为0.832，特异度为 0.765，AUC为0.832，AUC>0.7则反映预测的准确性较高，由此推测，血清miR-196a是诊断宫颈癌的较好指标。

综上所述，宫颈癌患者的血清miR-196a表达增高，且与肿瘤直径、淋巴结转移、FIGO分期、3年生存率相关;监测血清miR-196a表达有助于对患者病情进展和预后进行评估，同时血清miR-196a表达对宫颈癌诊断有较高价值。