熊建文，谢兆丰，江志忠，张建兴，邓伟，张利洪，张智伟

(1南方医科大学第五附属医院，广州510900；2广东省人民医院心血管病研究所)

促红细胞生成素(EPO)是红系细胞增生、分化及凋亡的关键调节因子。研究[1]发现，其对缺血再灌注损伤时的神经元有减少细胞凋亡的保护作用。另有研究[2]表明，转录因子GATA-4在减轻心肌细胞缺血再灌注损伤中发挥作用 。PI3K-Akt信号通路介导多个细胞内信号转导，通过影响下游多种效应分子的活化状态，促进细胞增殖[3]，为促肝细胞癌发生的分子机制之一[4]。肿瘤发生的机制主要为某组织出现失控的病理性增殖，生理性凋亡被重度抑制[5]。我们认为其促肿瘤效应通过PI3K/Akt途径激活、上调，发挥抗凋亡效应实现。这种分子机制的上调在心肌细胞缺氧情况下是否发挥保护作用尚不清楚。EPO是否对PI3K/Akt信号通路产生影响及进一步影响心肌细胞凋亡，目前尚不明确。2018年3～8月，本实验拟建立缺氧诱导心肌细胞凋亡实验模型，通过比色法和细胞流式法测定EPO或LY294002(PI3K特异性抑制剂)或IGF-1(PI3K特异性激活剂)干预下的肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活力、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)阳性表达率和细胞凋亡率的变化，明确EPO能否影响缺氧诱导的心肌细胞凋亡，同时探讨凋亡的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 新生1～3 d的雄性SD大鼠15只[南方医科大学实验动物中心提供,动物许可证号SCXK(粤))2007-0006]，体质量约300 g；重组促红细胞生成素(rhEPO)购自以色列ProSpec-Tany TechnoGene Ltd公司；肌酸激酶(CK)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；十二烷基硫酸钠(SDS)购自Sigma公司；CO2培养箱(Shellab 2306和Shellab 2323型，USA)；ELX800全自动酶标仪(USA)。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的人膜联蛋白V(Annexin V)联合碘化丙啶(PI)染色法细胞凋亡检测试剂盒购自美国Yeasen公司。

1.2 心肌细胞原代培养 无菌操作取出新生大鼠的心室肌组织，磷酸缓冲液(PBS)冲洗并剪碎，组织胰酶消化法分离细胞，差速贴壁法和BrdU化学抑制法纯化。用20%胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，并以1×109/L浓度接种至培养瓶中。5%CO2、37 ℃培养1～2 h,吸出细胞悬液,再接种至培养瓶中继续培养,每2～3 d换液,待细胞长至瓶底面积的80%时传代。

1.3 缺氧模型的建立及实验分组 实验前24 h按1×1010/L浓度接种至培养瓶中更换成无血清培养基，24 h后将培养瓶转至厌氧培养箱中，抽真空至0.1 mPa，以95%N2、5%CO2填充，培养3 h后即为缺氧新生大鼠心肌细胞模型，并移至CO2培养箱中常规继续培养1 h。设立正常对照组、缺氧组及低、中、高EPO干预组、LY294002干预组、IGF-1干预组共7组，正常对照组于CO2培养箱中培养，不经缺氧处理或药物干预。缺氧组细胞经缺氧处理，不予任何药物干预。低EPO干预组：以6.25 IU/mL的EPO预处理细胞24 h,再予缺氧处理。中EPO干预组：以25 IU/mL的EPO预处理细胞24 h,再予缺氧处理。高EPO干预组：以100 IU/mL的EPO预处理细胞24 h,再予缺氧处理。LY294002干预组：以LY294002(终浓度50 μmol/L)预处理1 h，后予缺氧处理。IGF-1干预组：以IGF-1(200 ng/mL)预处理细胞1 h,后予缺氧处理。

1.4 LDH、CK活力测定 采用比色法。细胞培养并分组干预结束后，按试剂盒操作说明书步骤收集细胞、处理检测样品，获得细胞上清液。最后用酶标仪在激发波长405 nm处测定光密度(OD)值，计算CK、LDH的活力。

1.5 Caspase-3阳性表达率测算 采用流式细胞术。完成细胞培养并分组干预处理，胰酶消化后离心,1 000 r/min，5 min,收集细胞，弃上清液，细胞转移至1.5 mL Eppendorf管中，然后进行以下操作：①用预冷的PBS洗2次；②细胞沉淀中加入300 L洗涤缓冲液，然后加入Caspase-3抑制剂Z-VAD-FMK 1 L，摇匀后置37 ℃、5% CO2孵箱中孵育30 min；③3 000 r/min，离心5 min，弃上清液，留用细胞沉淀，0.5 mL洗涤缓冲液重悬细胞沉淀，再次离心弃上清液，留细胞沉淀，进行2次0.5 mL洗涤缓冲液重悬细胞沉淀，流式细胞仪检测，用Multicycle软件分析Caspase-3表达。

1.6 心肌细胞凋亡率测算 采用流式细胞术Annexin V/PI双染法检测。完成干预培养后，选择对数生长期细胞，1 000 r/min,离心5 min,收集细胞，弃上清液，将细胞转移至1.5 mL Eppendorf管中，继续以下操作：①用预冷的PBS(pH7.4)将细胞沉淀离心(800 r/min,5 min)洗涤2次；②加入100 μL Binding缓冲液和FITC-Annexin V(20 μg/mL)10 μL,室温避光静置30 min；③加入PI(50 μg/mL)5 μL，避光反应5 min，加入400 μL Binding缓冲液。最后以FACScan进行流式细胞术检测分析。

2 结果

2.1 各组心肌细胞上清液中CK、LDH活力比较 经EPO预处理，缺氧诱导的心肌细胞CK、LDH活力降低，呈剂量依赖性，低EPO干预组、中EPO干预组、高EPO干预组组间CK、LDH活力比较，P均<0.01；各组心肌细胞上清液中CK、LDH活力比较见表1。

表1 各组心肌细胞上清液中CK、LDH活力比较

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与缺氧组比较，#P<0.01；与LY294002干预组比较，cP<0.01。

2.2 各组Caspase-3阳性表达率比较 正常对照组、缺氧组、低、中、高EPO干预组、LY294002干预组及IGF-1干预组Caspase-3蛋白阳性表达率分别为1.093±0.742、48.933±3.109、45.667±6.646、13.650±4.455、3.360±0.415、84.683±6.806、3.470±0.402，缺氧组Caspase-3蛋白阳性表达率高于正常对照组(P<0.01)。低、中、高EPO干预组Caspase-3蛋白阳性表达率均低于缺氧组(P均<0.01)，低、中、高EPO干预组间比较差异有统计学意义(P均<0.01)。

2.3 各组细胞凋亡率比较 正常对照组、缺氧组、低、中、高EPO干预组、LY294002干预组及IGF-1干预组心肌细胞凋亡率分别为0.63%±0.1%、35.6%±1.3%、22.4%±2.1%、12.9%±2.3%、5.39%±1.1%、83.5%±2.1%、5.01%±1.1%，各组间比较，P均<0.01。

3 讨论

凋亡造成心肌细胞减少是人类多种心脏疾病的重要原因，如缺血性心肌病等[6]。凋亡为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡，但凋亡发展至晚期阶段，其表现类似于细胞坏死。CK、LDH是位于细胞内的酶类，在凋亡晚期阶段，细胞膜破坏时释放至细胞外而被检测到，而心肌细胞富含CK、LDH。即使在临床实践中，比色法检测CK、LDH活力，亦是评估心肌细胞坏死的重要方法。

凋亡信号转导是一个复杂的、由Caspases家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，不同的启动性Caspases介导不同的凋亡信号。效应性Caspases激活后主要从以下几方面导致细胞凋亡：①激活凋亡特异性核酸酶，水解DNA导致细胞凋亡的发生；②降解细胞骨架蛋白；③裂解DNA修复的关键酶-多聚ADP核糖多聚酶等。正常细胞中Caspase-3以酶原形式存在于胞质中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的 Caspase-3由两个大小亚基组成, 裂解相应的胞质胞核底物，最终导致细胞凋亡。流式细胞术检测Caspase-3蛋白表达是当今研究细胞凋亡的主流方法之一。因此，Caspase-3常被作为细胞凋亡的早期检测指标。

在众多检测细胞凋亡的流式细胞术方法中，Annexin V /PI法是目前较为流行的检测方法。细胞凋亡早期，细胞膜脂双层结构中内层的磷脂酰丝氨酸外翻，暴露于细胞膜表面。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜结合。PI是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能透过细胞膜而使细胞核染红。PI 被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC- Annexin V 和PI 结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。因此，因此Annexin V/PI法是目前较为理想的检测细胞凋亡方法。其缺点是细胞膜的改变持续时间有限，选择检测的时机较重要[7]。

本实验结果显示，EPO预处理可减轻缺氧诱导的CK、LDH酶的活力，降低细胞Caspase-3的阳性表达率及Annexin V/PI法细胞凋亡率。CK、LDH作为心肌细胞坏死标志物，Caspase-3作为作为细胞凋亡指标，干预后上述指标均下降，且这种保护作用呈剂量相关性，证明EPO具有保护心肌细胞、减轻心肌细胞凋亡、抑制缺氧诱导心肌细胞损伤的作用。EPO干预后，Caspase-3阳性表达率和细胞凋亡率明显下降，进一步提示EPO具有抗细胞凋亡的效应。Yamanaka 等[8]夹闭脊髓的供血动脉4 min，建立脊髓缺血性损伤动物模型，注射EPO干预，结果提示EPO有协同二氮嗪减轻凋亡作用。另一项研究表明，EPO对癫痫持续状态的SD大鼠具有保护作用，其机制为减轻海马神经元的凋亡[9]。上述研究结果均提示EPO在不同组织细胞中均有抗凋亡、减轻缺血、缺氧损伤作用。本研究结果显示，EPO对心肌细胞有抑制凋亡、减少缺氧损伤的效应。EPO促红系细胞生成分化、组织保护等多种作用通过与不同受体结合实现。Leist等[10]研究发现，EPO的某些衍生物(如甲氨酰化EPO)或突变体不与经典的EPO受体结合，在动物体内和体外细胞实验中具有与EPO同等的细胞保护效力，但无促造血系统的作用。EPO促进红系细胞增殖、分化的作用广泛用于肾性贫血患者。近来年，EPO红系细胞外的机体保护作用逐渐受到重视，但多数研究均集中于EPO对神经系统的保护方面。与目前已有研究不同，本研究将EPO保护机制探索领域转移到心肌细胞，结果显示，PI3K特异性抑制剂LY294002预处理可加重缺氧诱导的心肌细胞凋亡；PI3K特异性激活剂IGF-1预处理可抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。提示PI3K/Akt信号途径活化可抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡，PI3K/Akt信号途径参与了缺氧诱导的心肌细胞凋亡机制。在EPO对视网膜神经节细胞[11]、神经元[12]保护作用研究中，ERK磷酸化介导EPO对细胞生存信号通路的促进，在EPO的保护机制中发挥关键作用。EPO的细胞保护作用还与维持线粒体跨膜电位有关[13]。如果检测线粒体跨膜电位将有助于了解EPO在本实验对线粒体稳定的影响。Chong等[14]研究发现，EPO对暴露于高糖中的血管内皮细胞有显著保护作用。这些实验使用不同细胞及诱导物，与本实验结果基本相同，EPO具有抗炎、抗过氧化、抗凋亡、促血管生成作用，从而发挥细胞保护作用。

综上所述，EPO可抑制缺氧诱导心肌细胞凋亡，其机制可能与PI3K/Akt信号途径有关。但本研究未能对PI3K蛋白表达和pAkt蛋白表达进行检测是本实验的局限之一。