夏天光，刁云锋，毕 莹，张 健，陈江龙，董化江，董月青

(武警后勤学院附属医院脑创伤与神经疾病研究所，天津 300162)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种能导致认知能力严重下降的神经退行性疾病[1]，其主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状。β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)是导致AD的关键因素，常以单体、可溶性或不溶性寡聚体及不溶性淀粉样纤维等形式存在，其聚集体具有明显的神经毒性，可在AD患者大脑神经细胞间形成老年斑，诱发神经元变性与凋亡。糖化β-淀粉样蛋白(glycated β-amyloid protein，Aβ-AGE)是一种高级糖化终产物(advanced glycation endproducts，AGEs)，其是以Aβ为底物的蛋白质氨基与还原糖及其衍生物的羰基在无酶条件下发生一系列糖化反应而产生的一种不溶于水、不被降解的交联体。AGEs通过AGEs受体(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)与神经元发生作用，可诱导神经元的氧化应激，促使相关细胞因子和Aβ的释放。Aβ是RAGE的一种配体，RAGE可促进Aβ生成，在Aβ介导的神经细胞毒性中起重要作用[5]。研究显示，Aβ-AGE可进一步促进Aβ聚积，且有更强的神经细胞毒性，在AD发病过程中的致病性强于Aβ[2-3]。本课题组既往研究表明，Aβ在体内外均能形成Aβ-AGE，且在体外Aβ-AGE会加剧Aβ诱导的神经细胞毒性[4]，但在体实验中，Aβ-AGE对AD样大鼠行为学改变及其作用机制尚不清楚。本研究旨在观察Aβ-AGE对AD样大鼠认知功能的影响，并探讨RAGE介导的信号转导通路在Aβ-AGE对AD样大鼠认知功能影响中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康无特定病原体级成年Sprague Dawley雄性大鼠40只，体质量 280～320 g，由解放军军事医学科学院提供,动物许可证号：0047126。

1.2 主要试剂与仪器小鼠单克隆RAGE抗体(receptor for advanced glycation endproducts mouse monoclonal antibody,Anti-RAGE)、小鼠单克隆β-肌动蛋白抗体(beta-actin mouse monoclonal antibody，Anti-β-actin)(美国Millipore公司),人β-淀粉样蛋白1-42(amyloid β1-42，Aβ1-42)、甲基乙二醛(methylglyoxal,MG)(美国Sigma公司)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗(美国Pierce公司)，聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白上样缓冲液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒、电化学发光(electro-chemi-luminescence，ECL)液(上海碧云天生物技术研究所)，二氨基联苯胺 (diaminobenzidine，DAB) 显色试剂盒、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(中国北京索莱宝科技有限公司)；DMS-2型Morris水迷宫测试系统(海欣曼科教设备有限公司)。

1.3 Aβ-AGE的制备无菌条件下取1 g·L-1的Aβ1-420.5 mL置于EP管中，加入0.5 mmol·L-1的MG缓冲液0.5 mL，在37 ℃孵育箱温育1个月，将混合液移入透析袋，扎紧透析袋并置入 1 mL 的 0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solation，PBS)中，于 4 ℃冰箱内进行转动透析,持续48 h，每 4 h 更换1次 PBS，除去MG，成功制备Aβ-AGE。将透析完毕的Aβ-AGE混合液于超净台滤过除菌，EP管分装，密封，-20 ℃储存。

1.4 动物分组与模型制备将40只大鼠随机分为Aβ组、Aβ+Anti-RAGE组、Aβ-AGE组、Aβ-AGE+Anti-RAGE组，每组10只。根据CHEN等[6]文献方法制备大鼠AD样模型。各组大鼠按 6 mL·kg-1的剂量给予60 g·L-1水合氯醛腹腔内注射麻醉，将大鼠固定于立体定向仪器上，选取前囟后1.0 mm、中线旁开1.5 mm、深度3.8 mm的位置，行左侧侧脑室注射，将相应的试剂溶于0.01 mL 30 g·L-1的BSA中，1次性注入左侧侧脑室，其中Aβ组大鼠给予Aβ 5 μg，Aβ+Anti-RAGE组大鼠给予Aβ 5 μg和RAGE抗体 Anti-RAGE 50 μg，Aβ-AGE组大鼠给予Aβ-AGE 5 μg，Aβ-AGE+Anti-RAGE组大鼠给予Aβ-AGE 5 μg 和Anti-RAGE 50 μg。

1.5 各组大鼠空间学习记忆能力检测采用Morris水迷宫实验观察各组大鼠空间学习记忆能力，包括潜伏期(即大鼠从入水至找到平台所用的时间)、目标象限停留时间和穿越平台次数等。在立体定向注射后第2～7 天，每只大鼠每天在第III象限训练 1 次，每次游泳的时间限为 60 s，大鼠爬上平台后，让其在平台上停留10 s；如在60 s内未找到平台者，系统自动停止记录，潜伏期记为 60 s，由测试者引导大鼠至平台，使其休息30 s；连续训练6 d，每日进行4次，记录大鼠寻找隐匿平台的潜伏期。立体定向注射后第9天移去水下平台，让大鼠自由游泳60 s寻找平台，记录大鼠在目标象限停留时间和穿越平台次数(即穿越平台所在区域的次数)。

1.6 Western blot法检测各组大鼠海马组织中RAGE的表达注射后第9天，水迷宫实验结束后，每组取5只大鼠断头取脑，冰上分离海马组织，取适量海马组织放入预冷裂解液(裂解液成分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐0.010 mol·L-1，氟化钠 0.050 mol·L-1，正钒酸钠0.001 mol·L-1，乙二胺四乙酸0.001 mol·L-1，甲脒0.001 mol·L-1，苯基甲基磺酰氟0.001 mol·L-1，0.001 mol·L-1丝氨酸蛋白酶抑制剂，基础溶剂为双蒸水)中，加入研磨珠，用组织研磨仪研磨60 s，冰上裂解 30 min，4 ℃ 12 000×g离心15 min，取上清液，加入聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白上样缓冲液制备大鼠脑组织蛋白样本。根据BCA蛋白定量试剂盒说明书检测样品中蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳：80 V电泳 30 min，之后120 V电泳50 min，300 mA 转膜 90 min，Tris-HCl 缓冲盐溶液洗膜 2 min，体积分数 50 g·L-1BCA封闭，室温摇床 1 h，Tris-HCl 缓冲盐溶液洗膜 3 次，每次8 min，分别加入一抗RAGE和Anti-β-actin进行孵育，其中RAGE和Anti-β-actin稀释比例为 11 000，4 ℃过夜，次日洗膜3次，37 ℃ 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗(15 000)孵育1 h，洗膜3次，采用ECL液进行显色，胶片曝光，定影，显影，使用Quantity One软件对蛋白条带进行灰度值分析，灰度值高则表明蛋白表达量多。

1.7 免疫组织化学染色法检测各组大鼠大脑皮层中RAGE蛋白表达注射后第9天，水迷宫实验结束后，每组取5只大鼠，按6 mL·kg-1的剂量给予60 g·L-1水合氯醛腹腔内注射麻醉，经心脏先灌注100 mL生理盐水，然后灌注40 g·L-1的多聚甲醛溶液400 mL，取大鼠大脑组织置于 40 g·L-1的多聚甲醛溶液20 mL中固定24 h。采用震荡切片机行大脑组织连续切片，制备海马组织的冠状切片，厚度为20 μm。每只大鼠选取3～5个连续切片，采用RAGE抗体进行免疫组织化学染色：取固定好的大脑震荡切片用 0.01 mmol·L-1的PBS震洗3次，每次5 min；然后滴加体积分数3 g·L-1的H2O2缓冲溶液以消除内源性过氧化物酶，室温放置15 min，用 0.01 mmol·L-1的PBS震洗3次，每次 5 min；加入50 g·L-1BSA封闭60 min；加入一抗RAGE(11 000)4 ℃过夜；次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗37 ℃ 孵育1 h，并用DAB显色 2 min，中性树胶封片，随机选取2组大鼠大脑皮层切片各3张，置于倒置显微镜下，每张切片计数5个视野，采用IPP 6.0软件计算大鼠大脑皮层RAGE阳性表达细胞数，细胞核呈现棕黄色细颗粒状物质沉积则为RAGE表达阳性。

2 结果

2.1 4组大鼠潜伏期比较结果见表1。在注射后第2天，各组大鼠潜伏期比较差异无统计学意义(F=3.767，P>0.05)。注射后第3～7天，各组大鼠潜伏期比较差异均有统计学意义(F=9.167、25.050、56.980、62.380、122.200，P<0.05)；Aβ-AGE组大鼠潜伏期显著长于Aβ组，Aβ+Anti-RAGE组大鼠潜伏期显著短于Aβ组，Aβ-AGE+Anti-RAGE组大鼠潜伏期显著短于Aβ-AGE组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 4组大鼠潜伏期比较

n/s234567Aβ1059.96±1.0549.37±1.6832.10±3.0533.13±3.5020.80±2.719.73±1.62Aβ-AGE1060.07±1.2157.83±3.25a42.27±1.10a42.53±4.42a34.57±1.40ba29.77±2.66aAβ+Anti-RAGE1059.00±1.7344.67±2.52a23.00±3.46a22.30±2.52a14.32±3.05a5.34±2.31aAβ-AGE+Anti-RAGE1060.07±1.9351.77±1.86b36.83±2.25b33.30±1.26b26.03±1.65b17.57±1.69bF3.7679.16725.05056.98062.380122.200P0.0600.0100.0000.0000.0000.000

注：与Aβ组比较aP< 0.05；与Aβ-AGE组比较bP<0.05。

2.2 4组大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间比较结果见表2。在立体定向注射后第9天，各组大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间比较差异均有统计学意义(F=12.930、13.560，P<0.05)。Aβ-AGE组大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间显著小于Aβ组，Aβ+Anti-RAGE组大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间显著大于Aβ组，Aβ-AGE+Anti-RAGE组大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间显著大于Aβ-AGE组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 4组大鼠穿越平台次数、目标象限停留时间比较

n/sAβ103.60±0.4629.33±2.52Aβ-AGE101.99±0.11a19.17±0.76aAβ+Anti-RAGE104.23±0.71a31.67±3.06aAβ-AGE+Anti-RAGE103.23±0.25b26.83±2.25bF12.93013.560P0.0000.000

注：与Aβ组比较aP< 0.05；与Aβ-AGE组比较bP< 0.05。

2.3 4组大鼠海马组织中RAGE蛋白表达比较结果见图1和图2。注射后第9天，Aβ组、Aβ+Anti-RAGE组、Aβ-AGE组、Aβ-AGE+Anti-RAGE组大鼠海马组织中RAGE蛋白相对表达量分别为0.56±0.03、0.47±0.08、0.77±0.11、0.48±0.07，各组大鼠海马组织中RAGE蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=8.626，P<0.05)；其中Aβ-AGE组大鼠海马组织中RAGE蛋白相对表达量显著高于Aβ组(P<0.05)，Aβ+Anti-RAGE组大鼠海马组织中RAGE蛋白相对表达量与Aβ组比较差异无统计学意义(P>0.05)；Aβ-AGE+Anti-RAGE组大鼠海马组织中RAGE蛋白相对表达量显著低于Aβ-AGE组(P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示，Aβ组、Aβ+Anti-RAGE组、Aβ-AGE组、Aβ-AGE+Anti-RAGE组大鼠大脑皮层中RAGE阳性细胞数分别为(25.10±0.15)、(17.23±2.25)、(38.17±2.16)、(23.16±1.20)个·cm-2，各组大鼠大脑皮层中RAGE阳性细胞数比较差异有统计学意义(F=76.370，P<0.01)；Aβ-AGE组大鼠大脑皮层中RAGE阳性细胞数显著高于Aβ组(P<0.01)，Aβ+Anti-RAGE组大鼠皮层中RAGE阳性细胞数显著低于Aβ组(P<0.01)；Aβ-AGE+Anti-RAGE组大鼠皮层中RAGE阳性细胞数显著低于Aβ-AGE组(P<0.01)。

A：Aβ组；B：Aβ-AGE组；C：Aβ+Anti-RAGE组；D：Aβ-AGE+Anti-RAGE组。

图1 各组大鼠海马组织中RAGE表达(Western blot)

Fig.1 Expression of RAGE in hippocampus of rats in each group (Western blot)

A：Aβ组；B：Aβ-AGE组；C：Aβ+Anti-RAGE组；D：Aβ-AGE+Anti-RAGE组。

图2 各组大鼠大脑皮层中RAGE阳性表达情况(免疫组织化学染色，×400)

Fig.2 Positive expression of RAGE in the cerebral cortex of rats in each group(immunohistochemical staining,×400)

3 讨论

AD是一种以进行性认知功能障碍为主要临床表现的神经退行性病变，其主要病理学特征是位于细胞内的神经纤维缠结和位于细胞外的老年斑。前者主要由过度磷酸化的tau蛋白聚积而成，后者的主要成分是Aβ[7]。大脑中葡萄糖代谢严重紊乱与AD的发展密切相关[8-9]，其会导致体内大量AGEs的形成和积聚，而AGEs已被证明与AD的发生密切相关[10-11]。AGEs的产生是一种涉及细胞内外环境的复杂的非酶促阶梯式反应过程[10]。在葡萄糖代谢和氧化应激过程中，AGEs的水平会显著提高，AGEs会导致许多活性羰基化合物的形成，而这些羰基化合物又可与蛋白质反应形成AGEs。AD患者或动物模型体内的AGEs水平明显升高。体外研究显示，AGEs修饰增加淀粉样蛋白的错误折叠[2]。在体研究表明，AGEs与AD病理性蛋白Aβ是共定位的[12]。以上研究提示，AGE修饰的蛋白质可能与AD的病理和发病机制有关。本课题组以往研究表明，Aβ-AGE可加重Aβ介导的体外培养海马神经元的神经毒性[13]，但其作用和潜在的体内机制仍有待进一步研究。为验证Aβ-AGE对AD样大鼠认知功能的影响，本研究将Aβ-AGE注入大鼠侧脑室，通过Morris水迷宫实验检测发现，与Aβ组相比，Aβ-AGE能显著延长大鼠寻找隐匿平台的潜伏期，减少穿越平台次数和目标象限停留时间，表明Aβ-AGE可加重AD样大鼠认知功能障碍。

RAGE是免疫球蛋白家族中的一个多配体受体，可与AGEs和Aβ结合。研究表明，RAGE在Aβ介导的细胞功能紊乱中起重要作用[14]。当Aβ在AD患者脑中累积时，RAGE表达水平增加，这种机制可能加重RAGE与配体相互作用所引起的细胞功能障碍[15]。之前本课题组观察到RAGE参与了Aβ-AGE对体外培养的神经元的损伤作用[13],但尚不清楚RAGE是否参与在体实验中Aβ-AGE诱导的AD样认知功能障碍。本研究通过观察RAGE是否参与Aβ-AGE对AD样大鼠认知功能的影响，Western blot结果发现，Aβ-AGE组大鼠海马组织中RAGE蛋白表达水平与Aβ组比较明显增高，Aβ-AGE+Anti-RAGE组大鼠海马组织中RAGE蛋白相对表达量显著低于Aβ-AGE组。免疫组织化学染色结果同样显示，Aβ-AGE组大鼠大脑皮层中RAGE阳性细胞数显著高于Aβ组，Aβ+Anti-RAGE组大鼠大脑皮层中RAGE阳性细胞数显著低于Aβ组；Aβ-AGE+Anti-RAGE组大鼠大脑皮层中RAGE阳性细胞数显著低于Aβ-AGE组，提示RAGE参与了Aβ-AGE诱导的认知功能障碍这一过程。

细胞内的AGEs可能是直接通过交联作用对蛋白产生影响，而细胞外的AGEs可能是通过与其受体相结合将信号传入细胞内而影响细胞内蛋白表达。有证据表明，RAGE表达的增加可使其诱导更为严重的细胞功能紊乱[16]。为了探讨RAGE介导的通路是否与Aβ-AGE的作用相关，本研究使用RAGE抗体阻断RAGE信号转导通路，结果观察到立体定向注射后第3～7天，Aβ+Anti-RAGE组大鼠寻找隐匿平台的潜伏期显著短于Aβ组，Aβ-AGE+Anti-RAGE组大鼠寻找隐匿平台的潜伏期同样显著短于Aβ-AGE组；在立体定向注射后第9天，Aβ+Anti-RAGE组大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间显著长于Aβ组，Aβ-AGE+Anti-RAGE组大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间同样显著大于Aβ-AGE组；以上结果提示，给予RAGE抗体阻断后，可以有效减轻大鼠空间记忆功能损伤，由此提示Aβ-AGE诱导的AD样认知功能障碍可能是通过干预RAGE信号转导通路而产生的。

综上所述，Aβ-AGE可加重AD样大鼠的认知功能障碍，并增加AD样大鼠脑组织RAGE的表达，而RAGE抗体能有效减轻由Aβ-AGE诱导的认知功能障碍。本研究进一步证实了Aβ-AGE可加重大鼠的神经损害，其机制可能是通过激活RAGE信号转导通路介导加重AD样大鼠的认知功能障碍，Aβ-AGE和RAGE可能成为新的AD治疗靶点。