于晓晴，钟根深，熊熙文，梁银明，王 辉，章小英，叶建平

(1.新乡医学院医学检验学院，河南 新乡 453003；2.河南省分子诊断与医学检验技术协同创新中心，河南 新乡 453003；3.新乡医学院医学法医学院，河南 新乡 453003；4.上海交通大学第六人民医院中心实验室，上海 201306)

细胞内三磷腺苷(adenosine triphosphate，ATP)主要在线粒体内合成，是细胞维持多种生命活动的能源[1-2]。线粒体合成ATP依赖三羧酸循环和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)。三羧酸循环是葡萄糖和脂肪酸释放能量的关键步骤，糖酵解产生的丙酮酸和脂肪酸经β氧化产生的乙酰辅酶A均需经过三羧酸循环为呼吸链提供电子，推动OXPHOS反应，合成ATP[1]。线粒体呼吸链的H+-ATP合酶具有合成和水解ATP 2种活性，参与细胞内ATP水平的调节。在心肌细胞和肝脏细胞中，H+-ATP合酶活性受线粒体ATP酶抑制因子1(ATPase inhibitory factor 1，ATPIF1)的调节，其分子机制是ATPIF1作用于H+-ATP合酶的F1区域，抑制ATP合酶的合成和水解功能[3-4]。这种调节的生物学意义是既防止ATP过度合成，也避免ATP过度水解消耗，从而维持细胞内ATP的动态平衡。在转基因小鼠肝细胞中，通过过表达ATPIF1基因增加ATPIF1基因的活性，引起H+-ATP合酶活性减弱，细胞内ATP水平降低[5]。此外，ATPIF1通过抑制ATP合成，可增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，触发细胞应激反应[6-8]。但是，ATPIF1的这些作用在巨噬细胞中还未见报道。本课题组前期研究结果表明，ATPIF1基因敲除增加了转基因小鼠成纤维细胞中的ATP水平，也促进成纤维细胞向脂肪细胞的分化[9]，但ATPIF1基因敲除对巨噬细胞代谢的影响尚不清楚。本实验通过检测细胞内ATP水平、氧耗量、三羧酸循环基因表达等指标，比较ATPIF1基因敲除小鼠和野生型(wide type,WT)小鼠巨噬细胞氧化磷酸化相关指标的区别，探讨ATPIF1基因敲除对小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophages，BMDM)内ATP水平的影响及调节机制，确定ATPIF1基因调节巨噬细胞能量代谢的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物WT雄性C57BL/6健康小鼠5只(WT组)，8～10周龄，体质量25～27 g；雄性ATPIF1基因敲除小鼠5只(KO组)，8～10周龄，体质量26～31 g。小鼠均由新乡医学院动物实验中心提供。小鼠饲养在无特定病原体级环境中，12 h 明暗交替，环境温度22～26 ℃，湿度40%～60%，低脂饲料喂养，自由摄食和饮水。

1.2 主要试剂与仪器达尔伯克改良伊戈尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)购自美国HyClone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司，巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)购自美国PepTech公司，脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)干粉购自美国Sigma公司，红细胞裂解液、ATP检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，线粒体压力试剂盒购自美国安捷伦科技有限公司，TRIzol、反转录试剂盒和SYBR green荧光染料购自大连宝生物工程有限公司；酶标仪购自美国Bio-Rad公司，4 ℃低温离心机购自美国Eppendorff公司，Seahorse XFe24细胞能量代谢分析仪购自美国安捷伦科技有限公司。

1.3 小鼠BMDM的获取与培养2组小鼠均使用100 g·L-1水合氯醛麻醉，脱颈处死，取双侧股骨与胫骨，在超净台内用体积分数75%乙醇浸泡3 min，小心剔除肌肉组织，完整暴露骨质，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗干净。切断骨质两端暴露骨髓腔，用1 mL注射器吸取低糖型DMEM冲洗出骨髓。获得的骨髓冲洗液经 1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，用3 mL 1×红细胞裂解液重悬细胞，冰上孵育5 min，每分钟摇晃1次离心管，去掉红细胞。加入10 mL PBS终止去红细胞反应，经1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，获得纯化的骨髓细胞。用含1 g·L-1低糖DMEM、 10 μg·L-1M-CSF、体积分数10%FBS和体积分数1%双抗的低糖完全培养基重悬细胞，并转移至培养皿中，在体积分数5%CO2、37 ℃环境下培养，分别在第3、5天更换新鲜培养基，第7天获得成熟的BMDM。

1.4 细胞处理成熟的BMDM用含4.5 g·L-1葡萄糖DMEM、体积分数10%FBS和体积分数1%双抗的高糖完全培养基在6孔细胞培养板中培养，每孔使用2.5 mL高糖完全培养基，培养24 h后，留取未经LPS刺激的细胞作为基础状态组，其余每孔加入25 μL浓度为 100 mg·mL-1的LPS分别刺激细胞2、4 h，用于进行下一步实验。

1.5 BMDM内ATP水平检测将6孔细胞培养板置于冰上，用预冷的PBS洗2次，每孔加入80 μL预冷的细胞裂解液，用细胞刮收集巨噬细胞，转至1.5 mL的EP管中，置于冰上继续裂解30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，采用ATP检测试剂盒检测上清液中ATP水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 线粒体氧消耗率(oxygen consumption rate，OCR)检测在荧光探针传感器板中，每孔加入 1 mL 海马仪水化液，置于37 ℃无CO2的培养箱孵育过夜；并将诱导成熟的BMDM按照每孔5×105个细胞铺在Seahorse细胞板中，置于细胞培养箱中培养过夜。实验开始前将细胞板中培养基换为上机检测液，于37 ℃无CO2的培养箱中培养30 min。取出活化好的荧光探针传感器板，在加药仓中加入相应所需药物：A孔每孔加入 10 μmol·L-1寡霉素 56 μL，B孔每孔加入20 μmol·L-1解偶联剂即三氟甲氧基苯腙羰基氰化物[carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone，FCCP]62 μL。加药以后将荧光探针传感器板放入Seahorse YFe24细胞能量代谢分析仪中，通过荧光探针传感器板先平衡好机器的温度和pH。平衡完成后，用已经处理好的海马细胞培养板替换下探针板，按照试剂盒说明书操作步骤检测线粒体的氧耗率。加入寡霉素后检测结果为细胞的基础氧耗量；加入寡霉素后减少的氧耗量为机体用于ATP合成的氧耗量；加入FCCP后的氧耗量为线粒体的最大氧耗量。

1.7 实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测三羧酸循环相关酶mRNA表达水平根据试剂盒说明书，用TRIzol试剂从细胞中提取和纯化总RNA。利用反转录试剂盒，将1 μg RNA反转录成cDNA，随后用SYBR Green qPCR Master Mix进行qRT-PCR反应，检测丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PKm)、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)、柠檬酸合酶 (citrate synthase，CS)、α-酮戊二酸脱氢酶(α-oxoglutarate dehydrogenase complex，OGDC)mRNA表达；反应体系为20 μL，体系包括SYBR Green Master Mix、cDNA模板、配对引物和无RNA酶H2O。磷酸甘油醛脱氢酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物序列为5′-GACGGCCGCATCTTCTTGT-3′，下游引物序列为5′-CACACCGACCTTCACCATTTT-3′；PKm上游引物序列为5′-CTCTGGGCTTTGCTT-CTGTA-3′，下游引物序列为5′-AGTCAGGAGACA-AAAGA-3′；IDH上游引物序列为5′-CTCCTGTGAC-CCAGCCTAA-3′，下游引物序列为5′-ACCGTTT-GGATTTCTGCTGA-3′；CS上游引物序列为5′-GTCCTCTCTCAGCAGGTC-3′，下游引物序列为5′-ACTATCTTCTGACCTTGG-3′；OGDC上游引物序列为5′-GAACAGAACCCTATGTGGCT-3′，下游引物序列为5′-AGGAGTAGTTTCATCTTGCTA-3′。以GAPDH为内参，WT组基础表达量为参照值“1”，使用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 2组小鼠BMDM内ATP水平比较结果见表1。在基础状态下，KO组小鼠BMDM内ATP水平显著高于WT组，差异有统计学意义(P<0.05)；LPS刺激2、4 h后，KO组小鼠BMDM内ATP水平显著高于WT组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 WT组和KO组小鼠BMDM内ATP水平比较

nATP/(μmol·L-1)LPS2 hLPS4 hWT533.52±0.343.04±0.208.40±0.54KO544.55±1.7222.84±1.4628.87±1.85t-1.870-2.761-2.481P0.0470.0110.017

2.2 2组小鼠BMDM内OCR比较结果见表2。基础状态下，KO组小鼠BMDM内基础氧耗量、用于ATP合成的氧耗量和最大氧耗量均显著高于WT组，差异有统计学意义(P<0.01)；LPS刺激2、4 h，KO组小鼠BMDM内基础氧耗量、用于ATP合成的氧耗量和最大氧耗量均显著高于WT组，差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 WT组和KO组小鼠BMDM内OCR比较

n/(pmol·min-1)ATP/(pmol·min-1)/(pmol·min-1)WT5 384.61±10.20199.18±6.95448.04±4.93 LPS2 h249.03±5.1489.44±3.04533.43±10.55 LPS4 h260.55±4.8398.39±4.11587.19±27.35KO5 449.72±3.42a272.64±11.82a574.05±6.10a LPS2 h364.49±15.23a140.48±4.79a660.60±20.41a LPS4 h373.47±9.37a146.05±8.85a773.08±39.46a

注：与WT组比较aP<0.05。

2.3 2组小鼠BMDM内三羧酸循环相关酶的mRNA相对表达量比较结果见表3。在基础状态下，KO组小鼠BMDM内三羧酸循环相关酶PKm、IDH、CS、OGDC mRNA相对表达量均高于WT组，差异有统计学意义(P<0.01)。LPS诱导2、4 h后，KO组小鼠CS、OGDC mRNA相对表达量高于WT组，差异有统计学意义(P<0.05)；PKm、IDH mRNA相对表达量与WT组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 WT组和KO组小鼠BMDM内三羧酸循环相关酶mRNA相对表达量比较

nPKm mRNACS mRNAIDH mRNAOGDC mRNAWT5 1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00 LPS2 h0.99±0.020.14±0.020.97±0.080.95±0.06 LPS4 h0.32±0.020.96±0.200.33±0.020.77±0.27KO5 1.94±0.04a1.37±0.01a1.72±0.03a1.57±0.10a LPS2 h0.93±0.051.84±0.48b0.92±0.031.28±0.07b LPS4 h0.30±0.012.34±0.21b0.30±0.012.26±0.03b

注：与WT组比较aP<0.01，bP<0.05。

3 讨论

ATPIF1是线粒体H+-ATP合酶的主要调节蛋白，其活性受磷酸化修饰调节[10-11]。研究表明，在小鼠心肌细胞和神经细胞中，ATP需求增加时，ATPIF1蛋白磷酸化水平增加，蛋白活性降低，从而提高H+-ATP合酶催化功能，线粒体产生ATP增加[3]。cAMP依赖蛋白激酶(protein kinase A，PKA)是目前已知唯一的ATPIF1磷酸化酶，在细胞能量需求增加时被激活，通过磷酸化ATPIF1提高H+-ATP合酶的催化作用[12]。在能量需求低时，ATPIF1蛋白磷酸化水平降低，蛋白活性增加，从而减少线粒体合成ATP。ATPIF1也过表达于结肠癌、乳腺癌、肺癌等大多数常见肿瘤中，肿瘤中高表达的ATPIF1处于去磷酸化活跃状态，可以抑制三羧酸循环并增强糖酵解，减少ATP的合成，促进肿瘤发生、发展[13-14]。ATPIF1通过抑制H+-ATP合酶的合成和分解，在细胞应激条件下加剧线粒体损伤，促进细胞凋亡。当呼吸链活动下降时，如药物毒性引起的细胞反应，会导致线粒体膜电位下降，这时，H+-ATP合酶可通过水解ATP，维持线粒体膜电位，保护细胞[12，15]。如果ATPIF1被激活，可降低H+-ATP合酶的这种保护作用，从而增加细胞损伤。文献提示，ATPIF1在肌肉、神经和肿瘤细胞中通过调控线粒体功能来调节ATP水平[3，13-14]，但其在巨噬细胞中的功能还不清楚。本研究通过对ATPIF1基因敲除小鼠BMDM的分析发现，ATPIF1基因敲除后BMDM内ATP水平明显升高，提示ATPIF1在巨噬细胞中也发挥调节作用。

有文献报道，在肿瘤细胞和转基因小鼠中，过表达ATPIF1基因可降低肿瘤细胞和神经细胞内ATP水平[7，15]。本课题组的前期研究发现，ATPIF1基因敲除小鼠成纤维细胞内ATP水平升高，并促进其向脂肪细胞分化，分化过程中细胞内三酰甘油含量明显增加[9]。本研究结果显示，在基础状态和LPS刺激下KO组小鼠BMDM内ATP水平、基础氧耗量和最大氧耗量均高于WT组。在基础状态下，KO组三羧酸循环功能提高，表现为CS、OGDC、PKm、IDH mRNA相对表达量高于WT组。在LPS诱导2、4 h时，KO组小鼠BMDM内CS和OGDC mRNA相对表达量高于WT组。这些结果表明，在基础状态和LPS刺激的应激状态下，ATPIF1基因敲除提高了巨噬细胞内ATP水平，其作用机制是增加线粒体功能，包括提高三羧酸循环和呼吸链运转水平，增加ATP合成。

LPS会引发促炎性免疫反应，这不仅能够清除入侵的致病原，还会导致线粒体功能障碍，对宿主组织造成损伤，因此，在必要时抑制LPS诱导的过激炎症反应是很重要的[16]。ATPIF1基因敲除对巨噬细胞免疫功能的影响还未见报道，本研究结果显示，在基础状态和应激状态下，ATPIF1基因敲除小鼠BMDM内ATP水平均高于WT组，而ATP能参与调节炎症过程，这已经在免疫细胞和非免疫细胞中被证实[17-19]。ATP被释放到细胞外后，成为细胞外ATP(extracellular adenosine triphosphate，eATP)，通过与细胞膜上的特异腺苷受体相互作用，调节细胞因子分泌[16]。在巨噬细胞中，eATP通过介导NLRP3的活化，促进炎症小体的聚集和炎性因子(白细胞介素-1和白细胞介素-18)的释放[20]。本课题组前期研究结果表明，细胞内ATP(intracellular adenosine triphosphate，iATP)可通过激活丝氨酸激酶诱导细胞因子表达[19]。本研究结果表明，在基础状态和LPS刺激2、4 h，KO组小鼠BMDM内基础氧耗量、用于ATP合成的氧耗量和最大氧耗量均高于WT组，提示ATPIF1基因敲除可提高巨噬细胞线粒体抵抗LPS毒性的能力。

综上所述，ATPIF1基因敲除可通过促进小鼠巨噬细胞中三羧酸循环活动，提高线粒体合成ATP水平和线粒体OXPHOS水平，增强巨噬细胞功能。