樊 娟 刘 华 田鸾英

深圳市南山区妇幼保健院儿科，广东深圳 518067

每个新生儿都有其独特的肠道微生物菌群图谱，肠道菌群定植也是一个复杂的过程[1]。有研究表明，早产儿胃肠道菌群结构紊乱，多态性薄弱，能扰乱肠道正常功能，导致健康菌群定植明显延迟，从而使早产儿致病菌定植增加、 免疫功能发育不健全以及感染增加，严重影响个体发育[2-3]。本研究通过Illumina HiSeq高通量测序平台，分析选取的2015年7月～2016年7月于深圳市南山区妇幼保健院新生儿科住院早产儿病例，探讨添加肠道微生态制剂对于早期早产儿肠道菌群的影响，进而证实尽早添加肠道微生态制剂有助于早产儿肠道有益菌的定植并促进其后期生长发育及健康。

表1 早产儿基本情况

1 对象与方法

1.1 对象

所有新生儿粪便标本均来源于深圳市南山区妇幼保健院新生儿病房，由1人收集。选取2015年7月～2016年7月在我院新生儿科住院早产儿，胎龄 32～34 周，出生体重在 1.5kg～2.5kg，母亲产前1月未使用抗生素及微生态制剂，产时无感染，患儿出生时无缺氧窒息等抢救病史并且未使用抗生素，生后混合喂养病例。选取45例患儿，随机分为g1、g2及g0组，因部分患儿失访或治疗过程因病情变化，从研究组中剔除，最终每组有6例患儿入组。每名患儿留取，生后 1d（t0）、7d（t1）、14d（t2）3个时间段大便标本。g1组生后即加用口服肠道微生态制剂双歧杆菌（0.5次，3次/d），疗程1周，g2组生后1周加用口服肠道微生态制剂双歧杆菌（0.5次，3次/d），g0组不添加肠道微生态制剂。对所选取3组早产儿病例从胎龄、性别、体重进行分析，均无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

1.2 方法

1.2.1 研究设计 本研究采集生后不同时间段添加益生菌的早产儿生后固定时间点标本，通过Illumina HiSeq高通量测序技术分析早期早产儿肠道内有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌含量的变化。

1.2.2 总DNA提取及PCR扩增 采用 CTAB方法对样本的基因组 DNA 进行提取，使用无菌水稀释样品至1ng/μL。以稀释后的基因组 DNA 为模板，根据测序区域的选择，使用带 Barcode 的特异引物，New England Biolabs 公司的 Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。引物对应区域：16S V4区引物（515F和806R）：此外，扩增区域还包 括：16S V3-V4/16S V4-V5；古 菌 16S V4；18S V9和ITS2区。

1.2.3 文库构建和上机测序 使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，文库合格后，使用HiSeq2500 PE250进行上机测序[4]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 早产儿肠道菌群结构

本研究共检出4个菌门为主：变形菌门（Proteobacteria），硬壁菌门（Firmicutes），类杆菌门（Bacteroidetes），放线菌门（Actinobacteria），且 3 个时间段均以变形菌门及硬壁菌门为主。

2.2 2菌群与口服肠道徽生态制剂的交互作用

2菌群均与口服肠道微生态制剂时间有交互作用，乳酸杆菌（F=7.48，P=0.006），双歧杆菌（F=6.91，P＜0.001），不同菌群不同时刻变化趋势不一致。见图1。

图1 2菌群分布轮廓图（A.乳酸杆菌；B双歧杆菌）

2.3 乳酸杆菌分布单独效应

乳酸杆菌分布固定组别单独效应见图1-A。g0、g1、g2组：菌落分布均呈逐渐上升趋势。乳酸杆菌分布固定时刻单独效应见表2。0时刻：3组标本在生后24h内均未检测出乳酸杆菌，可能与出生时含量少有关，当然也不能排除DNA提取的问题；1周组：g0，g1，g2菌落分布三组间总的有统计学差异，P＜0.05；2周组：g0，g1，g2菌落分布三组间总的有统计学差异，g1/g2组较g0组含量明显升高，P＜0.05，g1组较g2组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 t0、t1、t2不同时刻乳酸杆菌组间重复测量分析（n=18）

表3 t0、t1、t2不同时刻双歧杆菌组间重复测量分析（n=18）

2.4 双歧杆菌分布单独效应

双歧杆菌分布固定组别的单独效应见图1-B。g0、g1、g2组：菌落分布均呈逐渐上升趋势。双歧杆菌分布分布固定时刻的单独效应见表3。0时组：g0，g1，g2菌落分布三组间无统计学差异，P＞0.05；1周组：g0，g1，g2菌落分布三组间总的有统计学差异，P＜0.05；2周组：g0，g1，g2菌落分布三组间总的有统计学差异，g1/g2组较g0组含量明显升高，P＜0.05，g1组较g2组差异明显，P＜0.05。

3 讨论

目前的研究已经证实胎儿的肠道是存在细菌的，新生儿出生后肠道菌群的定植与建立是一个复杂的、连续演变的一个动态过程[6-7]。肠道菌群的种类、数量受多种因素影响，如环境、胎龄、喂养方式、分娩方式、药物应用等。早产儿肠道有益菌定植较迟，另外早产儿消化系统发育不成熟，胃肠动力、免疫防御等功能不完善，易患消化道疾病，因此尽早促进肠道有益菌定植，建立正常肠道菌群是尤为重要[8-10]。本研究采用高通量测序方法分析肠道菌群信息，与传统的培养方法及 16S rDNA为基础的分子生物学方法不同，高通量测序技术基于16S rDNA 的微生物群落分析中的要点，在于产生测序覆盖深度极深的测序数据，并通过比对或聚类的分析方法，对数据来源的微生物物种进行分析，并估计微生物群落的物种构成，进而全面、准确地获得菌群的信息[11]。本研究检测了18例早产儿生后1、7、14d大便标本，均能检测出细菌，但细菌种类及含量总体偏少，随后日龄增长肠道菌群逐渐发生变化，出生初期在门水平含量最高的是：变形菌门（Proteobacteria），硬壁菌门（Firmicutes），其次是：类杆菌门（Bacteroidetes），放线菌门（Actinobacteria）。后变形菌门比例出现下降，但仍为优势菌门，伴随有硬壁菌门及放线菌门含量上升。出生时肠道菌群组成以肠杆菌、链球菌、肠球菌、类杆菌等需氧菌或兼性厌氧菌为主，随后肠杆菌、肠球菌含量逐渐下降，而肠道有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌明显增加。

微生态制剂是比较安全的一类药物，在日本、芬兰、 意大利等发达国家，早产儿预防性使用益生菌制剂已作为常规治疗手段超过10年，迄今为止，在全球范围内没有微生态制剂引起严重毒副反应的报道[12]。双歧杆菌和乳酸杆菌是人体肠道正常菌群的主要菌种，也是目前微生态制剂应用最多的菌种，在发酵乳制品中的长期应用已经被证明了其安全性，极少有报道其潜在的致病性[13-15]。本研究中添加肠道微生态制剂周期虽短，但能促进肠道有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌生长，且尽早添加微生态制剂更能促进双歧杆菌定植。本研究亦有不足之处，添加肠道微生态制剂时间比较短，虽短期内达到预期效果，但远期作用未能进一步研究，从新生儿出生至2～3岁肠道菌群种类及数量才逐步稳定，而在此期间，早期短时间添加肠道微生态制剂是否对后期建立正常肠道菌群有帮助，是否与长期服用微生态制剂疗效一致，需进一步探讨。