赵晶晶

(山西省饲料兽药监察所,太原 030027)

马波沙星是隶属于喹诺酮类抗菌药，目前已在英国、法国、美国和欧洲上市并被列为动物专用药，马波沙星对多数肠杆菌、多杀性巴斯德氏菌、绿脓杆菌、金黄葡萄球菌、中间葡萄球菌的抑制和杀灭作用与恩诺沙星和环丙沙星相当，对红霉素、林可霉素、氯霉素、强力霉素、磺胺药的耐药病原菌依然有效。马波沙星组织渗透力强，在体内吸收迅速、完全、分布广泛，消除半衰期长，安全剂量范围宽，无明显生殖和遗传毒性[1-3]。无论是肌肉注射还是口服给药，生物利用度都高[4]。目前马波沙星已能在国内大规模生产，具有广阔的应用前景。

药物杂质影响药物质量和疗效,有必要掌握药物杂质的产生并采取一定的措施严格控制药品质量。药物的副作用与杂质有一定的相关关系,掌握微量杂质的形成并避免药物副作用具有重要意义[5]。研究人员采用高效液相色谱[6-7]及高效液相色谱串联质谱[8]的方法分析马波沙星及其代谢产物,以期对马波沙星药物评价提供一定的支持。 马波沙星化学名为9-氟-2,3-二氢-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶-[3,2,1-ij](4,1,2)苯并恶二嗪-6-羧酸，分子式为C17H19FN4O4，在贮藏过程中会产生杂质，其中以氧化杂质最为明显，氧化产物为1-氧-4-[9-氟--3-甲基-7-氧代2,3-二氢-7H-吡啶--[3,2,1-ij](4,1,2)苯并恶嗪-10-二甲基氨基]甲基哌嗪-6-羧酸,因而通过对氧化杂质含量的检测，可以对产品的质量稳定性做出判断。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器 安捷伦1100高效液相色谱仪，二极管阵列检测器。超声仪，昆山市超声仪器有限公司，KQ-250型。水浴锅，德国JULABO,TW12型。

1.1.2 对照品 马波沙星对照品，含量为100.0%，批号为PMAB160301B，马波沙星氧化物对照品含量为99.9%，批号为MABF-YXM-2028-007,二者均来源于海门慧聚药业有限公司。

1.1.3 其他试剂 甲醇为色谱纯试剂；其他试剂均为分析纯试剂。

1.1.4 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液 取磷酸二氢钾1.1998 g，置1000 mL量瓶中，加水950 mL使溶解，用磷酸调节pH值至2.6，用水稀释至刻度。

1.1.5 辛烷磺酸钠磷酸盐缓冲液 取辛烷磺酸钠2 g，置1000 mL量瓶中，加0.01 mol/L磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度。

1.1.6 稀释溶剂[9]取0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液650 mL，加甲醇320 mL,四氢呋喃30 mL,搅拌摇匀，过滤。

1.1.7 硼酸-氯化钾缓冲液(pH 9.0)[10]取硼酸3.09 g，加0.1 mol/L氯化钾溶液500 mL使溶解，再加0.1 mol/L氢氧化钠溶液210 mL，混匀。

1.1.8 马波沙星片 法国威隆制药股份有限公司(VETOQUINOL S.A.)生产，规格80 mg。

1.2 溶液的制备

1.2.1 马波沙星氧化物对照品储备液的配制 取马波沙星氧化物对照品50.05 mg，精密称定，置500 mL量瓶中，用水使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为氧化物对照品储备液。

1.2.2 马波沙星对照品溶液的配制 取马波沙星对照80 mg，精密称定，置200 mL量瓶中，用1.1.6项稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，超声处理5 min，置60 ℃水浴振荡3 min后，再超声处理10 min，摇匀，作为马波沙星对照品储备液。取3.00 mL储备液置100 mL容量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，作为马波沙星对照品溶液。

1.2.3 马波沙星氧化物标准工作液的配制 分别精密量取氧化物对照品储备液5、3、5、10、5、2、1、1 mL置10、10、25、100、100、100、100、200 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品工作液浓度分别为50、30、20、10、5、2、1、0.5 μg/mL。

1.2.4 供试品溶液的配制[9]取马波沙星片10片，研细，精密称取适量，约相当于马波沙星0.1 g，置100 mL量瓶中，用硼酸-氯化钾缓冲液(pH 9.0)溶解并稀释至刻度，摇匀，超声处理5 min，置60 ℃水浴振荡3 min后，再超声处理10 min，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置50 mL量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.2.5 光照破坏样品溶液的配制 取马波沙星片10片置玻璃平皿中，放在4500 lx的灯下照射1 d，研细，精密称取适量(约相当于马波沙星0.1 g)按1.2.4项方法配制，作为光照破坏样品溶液。

1.2.6 添加样品溶液的配制 农业部2329号公告中，马波沙星氧化物限量为不得过0.5%(W/W)，以此限度作为中间浓度，分别制备3个浓度的样品。取马波沙星片30片，研细，精密称取9份样品，每份样品约相当于马波沙星0.2 g，添加氧化物对照品三个浓度，分别添加 0.8、1、1.2 mg，每个浓度添加三份。完成添加后，置200 mL量瓶中，用硼酸-氯化钾缓冲液(pH 9.0)溶解并稀释至刻度，摇匀，超声处理5 min，置60 ℃水浴振荡3 min后，再超声处理10 min，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置50 mL量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，作为添加样品溶液。

1.2.7 马波沙星与马波沙星氧化物混合溶液的配制 取1.2.2项马波沙星对照品储备液15、20、25 mL分别置50 mL容量瓶中；取1.2.3项中浓度为5 μg/mL的马波沙星标准工作液10、20、30 mL分别置上述3个容量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液1～3。

1.3 色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶，4.6 mm×250 mm，5 μm。柱温 30 ℃。流动相：辛烷磺酸钠磷酸盐缓冲液-甲醇-四氢呋喃(65∶32∶3)。流速1.0 mL/min。检测波长210～400 nm，分辨率1.2 nm。记录298 nm波长处的色谱图。进样量 10 μL。

2 结果与分析

2.1 准确度 取1.2.6项添加样品溶液按1.3项色谱条件检测，结果见表1。

2.2 重复性 取1.2.7项马波沙星与马波沙星氧化物混合溶液1～3，按1.3项色谱条件检测，每份样品测定3次，计算马波沙星及马波沙星氧化物的响应因子，以响应因子作为评价依据，结果见表2。

表1 准确度测定结果Tab 1 Accuracy test results

表2 重复性测定结果Tab 2 Repeatability test results

续表

马波沙星氧化物相对于马波沙星的相对响应因子为1.03。

2.3 线性 吸取1.2.3项马波沙星氧化物标准工作液和1.2.1项氧化物对照品储备液，按照1.3项所述色谱条件测定，标准工作液色谱图见图1，测定结果见表3。以峰面积为纵坐标，以马波沙星氧化物质量浓度C(μg/mL)为横坐标线性回归，得回归方程为：Y=320.74X+56.382 (r2=0.9997)，检测结果表明，在0.5～100 μg/mL范围内有良好的线性关系。

表3 线性测定结果Tab 3 Linear measurement results

2.4 专属性 取1.2.2项马波沙星对照品溶液及1.2.5项光照破坏样品溶液，按照1.3项色谱条件测定，检测结果见图1～图6，马波沙星与马波沙星氧化物在检测过程中相互不干扰，马波沙星在光照条件下不稳定，由光照破坏样品溶液检测结果来看，马波沙星片产生的其他杂质与马波沙星氧化物峰的分离度良好，试验中采用了DAD检测器，在298 nm的色谱图上，马波沙星氧化物的相对保留时间为1.5，光谱图中马波沙星氧化物的吸收峰值的位置与马波沙星是相同的，用以上两点可以区分马波沙星氧化物和其他杂质，说明本分析方法可以较好地排除干扰，专属性强。

2.5 检测限 将1.2.6项中低浓度添加样品逐步稀释检测，以信噪比为3∶1时马波沙星氧化物的浓度作为检测限(图7)，检测限为0.2 μg/mL。

2.6 定量限 将1.2.6项中低浓度添加样品逐步稀释检测，以信噪比为10∶1时马波沙星氧化物的浓度作为检测限，定量限为0.5 μg/mL。

2.7 范围 根据2.3、2.4、2.5、2.6项的结果分析，马波沙星氧化物的浓度范围在0.2～100 μg/mL范围内均可获得可靠结果。根据农业部2329号公告该物质的限度为不得过0.5%(W/W)，按1.2.4项方法配制样品时，该限度在被测溶液中的浓度为1 μg/mL。因而，检测限、定量限、限度均在检测范围之内。

图1 马波沙星氧化物图谱(1 μg/mL)Fig 1 Marbofloxacin oxide chromatogram(1 μg/mL)

图2 马波沙星对照品图谱(12 μg/mL)Fig 2 Marbofloxacin chromatogram (12 μg/mL)

图3 马波沙星与马波沙星氧化物混合溶液图谱(马波沙星120 μg/mL、马波沙星氧化物1 μg/mL)Fig 3 Marbofloxacin and Marbofloxacin oxide chromatogram(Marbofloxacin 120 μg/mL、Marbofloxacin oxide 1 μg/mL)

图4 光照破坏马波沙星片样品图谱Fig 4 Marbofloxacin tablets chromatogram

图5 马波沙星氧化物光谱Fig 5 Marbofloxacin oxide spectrogram

图6 马波沙星光谱Fig 6 Marbofloxacin oxide spectrogram

图7 检测限图谱(0.2 μg/mL)Fig 7 limit of detection chromatogram(0.2 μg/mL)

2.8 耐用性 对流动相组成、缓冲液pH值、柱温、流速、色谱柱的品牌、柱长等因素进行考察，发现流动相比例在±5%，缓冲液pH值在±0.2 pH单位内，检测结果较为稳定，流速、色谱柱的品牌、柱长对保留时间影响明显，但马波沙星氧化物的相对保留时间均在1.5左右。柱温在±2 ℃范围内，相对保留时间较为稳定。

3 讨 论

任何影响药物纯度的物质均可能具有潜在的生物活性，药品在临床使用中产生的不良反应除了与药品本身的药理活性有关外，与药品中存在的杂质也有很大关系。因而在药品生产和贮存过程中控制药品中杂质的含量是非常必要的。在实际检测工作中，要求杂质的检测方法既能保证药品质量可控，又能方便快捷地完成检测工作。尤其在新产品、新剂型研发过程中根据每种药物独有的理化性质及稳定性情况，研究制定适宜的杂质检测方法成为质量标准研究的重要一环。马波沙星经加速和长期稳定性试验,在避光条件下保存具有较好的稳定性[11-12]，但在光照条件下，会出现多种杂质，氧化物是最明显的杂质，在查询到的相关文献中未见专门就马波沙星氧化物与马波沙星含量用高效液相色谱二极管阵列检测器检测结果的论述。本文的方法，用色谱图中的保留时间,结合光谱图最大吸收峰的位置,可以有效区分马波沙星氧化物与其他杂质，因而用马波沙星氧化物可以作为马波沙星片稳定性的标志物，通过控制马波沙星氧化物的含量来控制马波沙星片的杂质水平。由于马波沙星氧化物与马波沙星的结构十分相近[5]，发色基团是一致的，从本文的检测结果可以证实：二者光谱图基本一致，均在298 nm波长处有最大吸收，色谱图中马波沙星氧化物相对于马波沙星的相对响应因子为1.03。所以分析后认为，在马波沙星片有关物质的检测中可以采用自身对照的方法来检测并控制马波沙星氧化物的含量，这样更方便，更快速，可以避免马波沙星氧化物对照品的购置，线性溶液的配制及繁琐的计算。为避免在检测过程中产品受光照的影响，建议在检测过程中最好使用棕色容量瓶完成检测。