牛蒡子提取物长期毒性试验研究

2019-06-06何斌张海静杨文海邵志勇吴利军陈夏冰陈洁金尔光操继跃

中国兽药杂志 2019年5期

何斌，张海静，杨文海，邵志勇，吴利军，陈夏冰，陈洁，金尔光，操继跃

(1. 武汉市农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430208；2. 华中农业大学，武汉 430070；3.天津市宝坻区畜牧水产业发展服务中心，天津 301800)

牛蒡子是一种常用中药，具有疏散风热、宣肺透疹功效，临床上用于治疗外感风热、咳嗽气喘、咽喉肿痛等症[1]。牛蒡苷元为牛蒡子和牛蒡子提取物的直接有效成分[2]，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗糖尿病等众多药理作用[3-4]，具有良好的研发和应用前景；根据兽药长期毒性试验指导原则的方法要求[5]，研究了牛蒡子水提物在Wister大鼠体内经口给药后的30 d长期毒性，确定牛蒡子提取物对大鼠的毒性作用性质和靶器官，评价其亚慢性摄入的危险性，为临床试验剂量设计及观察指标的选择提供参考，为新兽药的研发和临床用药提供理论资料，为中兽药现代化进行有意义的探索。

1 材料

1.1 仪器设备注射器、烧杯、小鼠灌胃针；小鼠独立送风(IVC)系统；手术剪、镊子，JY2002型电子天平、岛津AUY2002型分析天平，日立7020型全自动生化分析仪，迈瑞BC-2600全自动血液分析仪。

1.2 药品与试剂牛蒡子提取物粉：含牛蒡苷元3.03%，由实验室自制，使用时，用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液配制成混悬液；

羧甲基纤维素钠：由国药集团化学试剂有限公司生产，使用时，用蒸馏水配制成0.5%的水溶液，放置于4 ℃冰箱内，限7 d内使用；

甲醛：由国药集团化学试剂有限公司生产，使用时用蒸馏水配制成10%的福尔马林溶液，用于固定组织。

对照品的配制：0.5%羧甲基纤维素钠，准确称取0.5 g羧甲基纤维素钠，溶解于100 mL蒸馏水中，作为对照品，保存于4 ℃冰箱内，限7 d内使用。

供试品的配制：准确称取牛蒡子粉3.75、7.5、15.0 g，溶解于50 mL的0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，配成均匀混悬液，浓度分别为0.075、0.15、0.3 g/mL，对应的剂量分别为1.5、3、6 g/kg.bw，现配现用，灌胃前充分摇匀。

1.3 试验动物 SPF级Wistar大鼠，80只，雌雄各半，4～6周龄，体重80～100 g，差异不超过平均体重的20%。大鼠由华中科技大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2010-0009。大鼠购买后在实验室动物房内预饲养一周，饲喂不含任何药物的全价营养颗粒饲料。实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2014-0081。实验动物的饲养与管理严格按照《实验动物饲养与使用原则》的要求进行，整个试验过程中保持室内清洁卫生，空气流通。

2 方法

2.1 动物分组将80只Wistar大鼠随机分为4组，即空白对照组和牛蒡子粉低、中、高三个剂量组，每组20只，雌雄各半。大鼠每笼2只，雌雄分开，饲养在不锈钢笼中，自由饮水和采食。室温控制在20～25 ℃，相对湿度40%～70%，照明采用人工昼夜，12 h照明(早7点～晚7点)，12 h黑暗(晚7点～早7点)，每日更换新鲜自来水，每周更换2次垫料。

2.2 剂量设计根据《兽药研究技术指导原则》，对于求不出LD50且靶动物可能摄入量较大，剂量设计无法达到靶动物可能摄入量100倍的药物，高剂量组可以按最大耐受量设计。基于此，由于牛蒡子粉最大溶解浓度及大鼠灌胃体积的限制，将高剂量组设计为6 g/kg.bw(牛蒡子粉的最大可溶解浓度0.3 g/mL，大鼠灌胃体积2 mL/100g.bw)。根据低剂量组应高于药效学有效剂量，结合《中华人民共和国兽药典》和药效学资料，设计低剂量组剂量为1.5 g/kg.bw。在高、低剂量组之间按剂量比设计中剂量组剂量为3 g/kg.bw。

2.3 给药方法及时间灌胃给药，各剂量组采取等体积不等浓度的给药方式，给药过程中始终进行搅拌以保证药液均匀。对照组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠。每周给药7 d，每天给药1次，每周根据体重变化调整1次给药量，给药期限为30 d。

2.4 观察指标

2.4.1 一般临床症状每天观察各组大鼠的一般生理指标，主要包括外观体征和行为活动，如精神状态、采食量和饮水量、体重变化、粪便颜色与性状、腺体分泌、呼吸状况、中毒症状和死亡情况等。如果发现异常，如过度兴奋、躁动、惊跳、肌肉麻痹或震颤、精神萎靡、蜷缩不动、步态异常、皮毛污秽或死亡等情况，均应进行详细记录并处理。若在试验过程中发现濒死或死亡大鼠，详细记录大鼠死亡前的异常表现及死亡时间，并分析死亡原因是否为药物引起[6-7]。

2.4.2 体重和进食量每周日记录大鼠体重，并根据体重调整大鼠给药量，每周一开始按调整后的剂量给药。

每周日称量动物的给料量和剩余量，计算动物的进食量及饲料利用率。在实验过程中，除每周日外，其余时间若发现饲料不够，可随时添加饲料，并如实记录。

2.4.3 血液学检查试验结束时进行血液学检查。采血前对各剂量组大鼠禁食16 h，3%戊巴比妥钠溶液(80 mg/kg.bw)麻醉，腹主动脉采血2 mL。采集的血样于血细胞分析仪上检测红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、淋巴细胞(LY)、单核细胞(MO)等血液学指标[8]。

2.4.4 血液生化检查试验结束时测定血液生化指标。3%戊巴比妥钠溶液(80 mg/kg.bw)麻醉，腹主动脉采血2 mL，将采集血液呈45～60度角于4 ℃冰箱放置1 h，3000 r/min离心5 min分离血清，于生化自动分析仪上测定血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血糖(Glu)、总胆固醇(TCH)和甘油三酯(TG)等指标[9]。

2.4.5 脏器重量和脏/体比值采血后处死动物，解剖，肉眼观察每只动物心、肝、脾、肺、肾、胃肠等胸腹腔内器官有无颜色改变以及渗出、水肿、增生、萎缩等病变，做好记录。用眼科镊和眼科剪分离心、肝、脾、肺、肾、胃肠、睾丸(雄性)子宫(雌性)、卵巢(雌性)等脏器，清除干净各脏器周围结缔组织和脂肪组织，用电子天平逐一称重(胃肠除外)，计算脏/体比值，再用10%福尔马林溶液立即固定[10]。

2.4.6 病理组织学检查病理切片检查：若大体解剖肉眼未见异常，选取高剂量组和阴性对照组作病理切片。选取高剂量组和阴性对照组各20只动物(雌雄各半)的部分脏器(肝脏、脾脏、肾脏、胃肠、卵巢和睾丸)，取材后，常规脱水、透明、浸蜡、制片及HE染色，在光学显微镜下由低倍至高倍观察各组织的形态学变化，并详细记录描述所观察到的形态学变化[11]。

病理结果评价标准：与阴性对照组比较，以镜下形态学变化进行描述判断。

病理组织学观察：依各脏器形态学结构各异，但主要是以细胞变性作为观察指标，并根据病理改变程度“-”、“+”“++”、“+++”量化，本试验所获数据采用非参数统计法(Nonparametric statistic)进行病理改变的评价。细胞变性及细胞坏死评价分级如表1、表2所示。

表1 细胞变性评价表Tab 1 Evaluation table of cell degeneration

表2 细胞坏死评价表Tab 2 Evaluation sheet for cell necrosis

2.5 统计分析实验数据采用Microsoft Excel软件建立数据库，对大鼠的体重、采食量、各项血液学指标及脏/体比值进行统计处理，并列表说明。各项数据以“平均数±标准差”表示，计量资料采用方差检验，计数资料采用非参数检验，并按动物性别分别统计。

3 结果与分析

3.1 一般观察试验期间每天观察大鼠的行为活动，各剂量组大鼠均无死亡现象，精神状态良好，活动正常，未出现过度兴奋、躁动、精神萎靡、步态异常或腺体分泌异常等现象，被毛整洁有光泽，无脱毛现象，粪便颜色、硬度均正常。

3.2 对大鼠体重、进食量及饲料利用率的影响在试验观察期内，高剂量组的每周体重及进食量与中、低剂量组及空白对照组相差异不显著(P>0.05)。各剂量组雌鼠与雄鼠饲料利用率随着时间的增长而逐渐降低，开始阶段雌鼠与雄鼠体重相差不大，饲料利用率比较接近，后来由于雄鼠进食量大、体重增长快，饲料利用率高于雌鼠，但雌雄各剂量组大鼠饲料利用率与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)，见表3、表 4、表 5。