宋鹏，龙彤，梁培育，欧善际

[编辑：安凤；校对：黄园玲]

0 引言

前列腺癌（prostate cancer, PCa）是男性泌尿生殖系统发病率较高的恶性肿瘤之一，近年来我国前列腺癌发病率呈上升趋势[1]。因此，研究前列腺癌的致癌机制，开发新的研究方法，对挽救前列腺癌患者的生命具有重大意义。随着二代测序技术的发展，大量对长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）的深入研究结果发现一些异常表达的lncRNA与肿瘤的发生与发展有关[2-4]。

肺腺癌转移相关转录子1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1）属于lncRNA中的一种，研究发现，book=412,ebook=30MALAT1的表达与癌细胞的增殖、转移、成瘤率及血管生成密切相关[5]。本研究以激素依赖性的前列腺癌细胞株PC3、LNCaP为对象，构建MALAT1过表达及干扰模型，通过对MALAT1过表达（或干扰后）前列腺癌细胞生物学行为变化的检测，探讨MALAT1在前列腺癌增殖中的作用机制，为研究前列腺癌发生发展机制奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

激素依赖性前列腺癌细胞株PC3和LNCaP（武汉华联科生物技术有限公司，中国武汉）；载体pCDH、pSICOR（Addgene，美国）；RPMI 1640培养基（HyClone，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；TRIzol（Ambion，美国）；YBR Green PCR试剂盒（KAPA Biosystems，美国）；反转录试剂盒（TaKaRa，中国大连）；PBS、胰蛋白酶、MTT、瑞氏-姬姆萨复合染液（Bioswamp，中国）；细胞周期检测试剂盒、凋亡检测试剂盒（BD，美国）；Matrigel（Corning，美国）；兔抗人Cyclin D1单克隆抗体、兔抗人Bcl-2单克隆抗体、兔抗人Bax单克隆抗体及兔抗人ERK1/2单克隆抗体（Abcam，英国）；兔抗人p-ERK1/2单克隆抗体（CST，美国）。

1.2 细胞复苏与培养

将冻存的PC3及LNCaP细胞从液氮罐中取出后，移至37℃水浴中，将细胞悬液吸至离心管中，1 000 r/min离心3 min，弃上清液，在含10%胎牛血清的新鲜RPMI 1640培养基中培养，并置于37℃、含体积分数为5%CO2的培养箱内。

1.3 构建MALAT1过表达及siRNA载体

为了探讨lncRNA-MALAT1对前列腺癌细胞增殖的作用机制，本研究构建了MALAT1过表达载体pCDH-MALAT1和干扰载体pSICOR-shMALAT1，以及起对照作用的过表达空载体和干扰空载体。MALAT1-siRNA序列：5’-TGTACTAT CCCATCACTGAAG-3’。

1.4 荧光定量PCR检测MALAT1相对表达量

利用TRIzol提取PC3细胞的总RNA，反转录生成cDNA，进行Real-time PCR扩增。MALAT1扩增引物序列：上游引物：5’-CCGCTGCTATTAGAATGC-3’；下游引物：5’-CT TCAACAATCACTACTCCAA-3’。内参基因β-Actin上游引物：5’-ACACTGTGCCCATCTACG-3’；下游引物：5’-TGTCACGCACGATTTCC-3’。PCR反应条件：95℃ 3 min；95℃ 5 s；56℃ 10 s；72℃ 25 s，共39个循环。

1.5 MTT检测细胞增殖

取对数生长期细胞，调整浓度并分于96孔板，每种细胞设置3个复孔，37℃培养过夜。根据实验分组：（1）对照组（Control）；（2）过表达空载体组（EV）；（3）干扰空载体组（si-EV）；（4）MALAT1过表达组（MALAT1）；（5）MALAT1-siRNA干扰组（si-MALAT1），分组处理细胞，继续培养24、48和72 h。取出不同分组的细胞培养板，每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml），继续培养4 h。最后用酶联免疫检测仪测量各孔490 nm处的吸光度值。

1.6 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡

收集胰酶消化处理后的不同细胞，PBS清洗两次以后，加入400 µl碘化丙啶（propidium iodide, PI）溶液（50 μg/ml），避光染核10 min，用流式细胞仪测定细胞含量，确定细胞在有丝分裂各个时期所占的比例。将细胞重悬于200 μl结合缓冲液中，并加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI溶液，轻轻混匀，4℃避光孵育30 min。最后，加入300 μl缓冲液，随即用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.7 基质胶检测成管能力

在96孔板中加入50 μl Matrigel基质胶，在凝胶过程中，消化各组细胞并用PBS重悬，制备细胞悬液，加入100 μl细胞悬浮液。37℃孵育，14 h后观察细胞成管情况。

1.8 平板克隆检测细胞成瘤率

取对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化处理后吹打成单个细胞，并培养于含10%胎牛血清的培养液中备用。将细胞梯度稀释，放置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养2~3周。4%多聚甲醛固定细胞，加适量GIMSA染色液进行染色。

1.9 Western blot检测细胞周期及凋亡相关蛋白表达

本研究利用Western blot实验检测了Cyclin D1、Bcl-2、Bax及ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表达水平，实验过程如下：提取细胞蛋白并置于沸水浴中10 min，使蛋白变性。利用SDS-PAGE胶分离蛋白，电泳结束后湿转法将蛋白转印至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次，再加入二抗（1:10 000稀释HRP标记），室温孵育1 h。PBST洗涤三次后用ECL化学发光检测并拍照。

book=413,ebook=31

1.1 0 统计学方法

2 结果

2.1 MALAT1在PC3中的相对表达量

荧光定量PCR检测前列腺癌细胞株PC3对照组、EV组、si-EV组、MALAT1组及si-MALAT1组中lncRNA-MALAT1的相对表达量。对照组与EV组、si-EV组的MALAT1相对表达量之间的差异无统计学意义；与对照组相比，MALAT1组中MALAT1表达量明显上调（P<0.01），si-MALAT1组中MALAT1表达量明显下调（P<0.01），说明MALAT1过表达和干扰细胞株构建成功，见图1。

图1 PC3中MALAT1的相对表达量Figure1 Relative expression of MALAT1 mRNA in PC3 cells

2.2 MALAT1对前列腺癌细胞体外增殖能力的影响

MTT检测了培养24、48及72 h的PC3和LNCaP细胞株的细胞增殖情况，描绘对照组和四组实验组细胞的生长曲线。结果显示，MALAT1组的前列腺癌细胞体外增殖能力明显高于对照组和EV组（P<0.01）；si-MALAT1组的前列腺癌细胞的增殖能力明显低于对照组和si-EV组（P<0.01），见图2。

2.3 MALAT1对前列腺癌细胞周期和凋亡的影响

PC3和LNCaP细胞中MALAT1组处于静止期和DNA合成前期（G0/G1期）的细胞数量多于对照组，在DNA合成期（S期）的细胞少于对照组；si-MALAT1组处于G0/G1期的细胞数量少于对照组，而S期细胞多于对照组，见图3。MALAT1组的细胞凋亡率与对照组细胞凋亡率相近；si-MALAT1组的细胞凋亡率高于对照组，见图4。

2.4 MALAT1对前列腺癌细胞血管形成能力的影响

PC3、LNCaP细胞中，与对照组比较，MALAT1组细胞形成的管状结构更多，在主要的管状结构附近聚集的血管内皮层细胞也更多，更容易形成分支。而si-MALAT1组的内皮层细胞少，基本没有形成管状结构，见图5。

2.5 MALAT1对前列腺细胞克隆形成能力的影响

MALAT1组的PC3、LNCaP细胞的克隆数量明显多于对照组，说明MALAT1组细胞的克隆形成能力明显增强。si-MALAT1组的细胞数量明显少于对照组，克隆形成能力减弱，见图6。

2.6 MALAT1对Cyclin D1、Bcl-2、Bax及p-ERK1/2蛋白表达的影响

与对照组相比，MALAT1组细胞中参与周期调控的Cyclin D1蛋白、抗凋亡蛋白Bcl-2及磷酸化的细胞外信号调节激酶（p-ERK1/2）的表达水平显著升高（P<0.01），而促凋亡蛋白Bax的表达水平明显降低（P<0.01）；si-MALAT1组的Cyclin D1、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表达水平显著降低（P<0.05或P<0.01），Bax表达水平升高（P<0.01），见图7。

图2 MALAT1对细胞增殖能力的影响Figure2 Effects of MALAT1 on proliferation of PC3 and LNCaP cells in vitro

book=414,ebook=32

图3 MALAT1对PC3、LNCaP细胞周期的影响Figure3 Effects of MALAT1 on cell cycle of PC3 and LNCaP cells

图4 MALAT1对PC3、LNCaP细胞凋亡的影响Figure4 Effects of MALAT1 on apoptosis of PC3 and LNCaP cells

图5 MALAT1对PC3、LNCaP细胞血管形成的影响 (×100)Figure5 Effects of MALAT1 on angiogenesis of PC3 and LNCaP cells (×100)

book=415,ebook=33

3 讨论

前列腺癌的发病率随着生活质量的提高呈现上升趋势，对前列腺癌的发生和发展研究也随之增多。近些年研究发现lncRNA在前列腺癌的发生发展过程中扮演了重要的角色：Chung等研究发现PRNCR1（前列腺非编码RNA1）-siRNA会减弱前列腺癌细胞的生存、增殖能力和雄激素受体的活性，揭示PRNCR1通过影响雄激素受体活性参与前列腺癌的发生过程，为前列腺癌的发病机制提供了新的认识[6]；lncRNA SOCS2-ASI可以促进前列腺癌细胞的生长、抑制凋亡，对前列腺癌的发生发展影响甚大[7]；Liu等发现lncRNA-PVTI在前列腺癌发生过程中表达上调，进一步研究其影响机制，发现lncRNA-PVTI与miR-146a存在调控关系，过表达lncRNA-PVTI或沉默miR-146a，可明显提高前列腺癌细胞的活力，抑制细胞凋亡[8]。

MALAT1是一种致癌性的长链非编码RNA，参与癌细胞的增殖、转移等过程，在宫颈癌、结直肠癌、非小细胞肺癌以及食管鳞状细胞癌等癌细胞中都表达上调[9-12]。Cai等发现，MALAT1在人骨肉瘤细胞和组织中都表达上调，而敲除MALAT1显著抑制了骨肉瘤细胞的增殖和迁移，并诱导了细胞的周期阻滞和凋亡，这些结果表明MALAT1在骨肉瘤中有促癌的作用[13]。Ren等的研究表明MALAT1也参与了前列腺癌细胞的发展过程，发现MALATI-siRNA抑制了前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并在G0/G1期诱导周期阻滞，可作为去势抗性前列腺癌的潜在治疗靶点[14]。Cyclin D1是周期蛋白家族成员之一，细胞从G1期进入S期需要Cyclin/CDK进行调控[15]。本研究结果发现MALAT1过表达后细胞增殖能力增强，且促进了细胞从G0/G1期向S期转换，进一步检测周期蛋白Cyclin D1表达，显示MALAT1过表达组的Cyclin D1蛋白表达量显著高于对照组，而干扰组降低，该结果说明MALAT1过表达促进Cyclin D1高表达，从而促进了细胞增殖。对细胞凋亡情况进行研究，发现MALAT1过表达组凋亡率降低，干扰组升高，MALAT1过表达组的抗凋亡因子Bcl-2高表达，而促凋亡因子Bax低表达，MALAT1表达干扰后结果相反，说明MALAT1过表达会抑制癌细胞凋亡，干扰MALAT1表达则促进细胞凋亡。本研究还检测了各组细胞p-ERK1/2蛋白相对表达量，结果显示MALAT1过表达组高表book=416,ebook=34达p-ERK1/2，推测MALAT1促进了ERK1/2信号通路的激活，进而影响前列腺癌细胞的生物学行为发生变化。

图6 MALAT1对PC3、LNCaP细胞克隆形成能力的影响Figure6 Effects of MALAT1 on clone formation of PC3 and LNCaP cells

图7 MALAT1对Cyclin D1、Bcl-2、Bax及p-ERK1/2表达的影响Figure7 Effects of MALAT1 on expression of Cyclin D1, Bcl-2, Bax and p-ERK1/2

综上所述，MALAT1过表达促进前列腺癌细胞的增殖，抑制凋亡，在前列腺癌的发生、发展过程中发挥重要的作用。而干扰MALAT1的表达后，抑制了癌细胞的增殖，并促进其凋亡，推测抑制MALAT1表达会对前列腺癌的治疗具有非常重要的意义，但lcnRNA-MALAT1对前列腺癌的具体作用机制还需进一步深入研究。

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