李统华, 冯中红, 杨成德

(甘肃农业大学植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

植物内生细菌(endophytic bacteria)指生活史中某一阶段或全部阶段生活在健康植物组织内又不对植物组织造成病害的细菌[1]。内生细菌存在于植物的根、茎、叶、花、果实等部位，是一类巨大的微生物资源。通过溶磷、固氮和分泌IAA等增进宿主植物生长发育，提高宿主植物的产量、抗寒、耐热和抗病虫害等抵抗逆境的能力[2-3]。Rashid等[4]报道了内生细菌分泌IAA等促进植物生长，江绪文等[5]报道了藿香内生细菌HX-2能使藿香种子的发芽势、发芽率以及藿香幼苗的株高、根长、叶面积、鲜重、干重、叶绿素含量和根系活力显著提高。东祁连山位于青藏高原边缘，甘肃、青海交界处[6]，特殊的地理位置和气候条件，形成了独具特色的高寒草甸生态系统，高寒草甸牧草及内生菌是其重要组成部分，维持着生态系统的平衡，牧草内生细菌因其特殊的生境和在生态系统中的作用，具有分泌IAA、溶磷和固氮等特点[7-8]。目前，国内外农药的病害主要依靠化学农药，尽管效果可观，但化学农药的使用会引起植物病原菌产生抗药性、农药残留、环境污染和生态破坏等问题[9]，而生物防治既可取得良好的防治效果，又能克服以上缺点，已成为目前研究热点[10]。但有关特殊生境高寒草甸牧草内生细菌的研究报道较少[11]，优良菌株开发潜力值得人们深入探讨。本试验对菌株261MY6抑菌谱、溶磷、固氮和分泌IAA能力等进行了测定，旨在为高寒草甸牧草内生细菌开发利用提供理论依据，也为植物病害生物防治提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病原细菌：番茄丁香假单胞叶斑病菌(Pseudomonassyringa)；病原真菌：马铃薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、马铃薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)、马铃薯褐腐病菌(Stysanusstemonitis)、黄瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番瓜根腐病菌(Fusariumsp.) 和孜然根腐病菌(F.Solani)；拮抗菌株：分离自高寒草甸牧草健康根、茎、叶、花部位内生细菌120株。以上菌株均由甘肃农业大学植物保护学院植物病原细菌及生物多样性实验室提供。

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基NA[11]、PDA培养基[11]、King培养基[11]、PKO培养基[11]、孟金娜培养基[11]和阿须贝培养基[11]。

试剂：Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(购于天根生化科技有限公司)；引物：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，

UP-1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCATGCCGGTGGAAAGTTCGA-3′，

UP-2：5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAG-CCATCTACGTCAGCGTCAGTCAT-3′；DL2000 Marker、2×Power Taq Mixture均购于上海生工生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1拮抗菌株筛选 采用含菌平板抑菌圈测定法[12]筛选优良拮抗菌株。以番茄丁香假单胞叶斑病菌作为指示菌，将其含菌量为108CFU·mL-1菌液加至灭菌后的NA培养基中混匀制成含菌平板，在平板上分别等距离点接不同的拮抗菌株，每株3次重复，于28℃恒温培养箱培养，2 d后测量并记录抑菌带宽度。

1.2.2生物功能的测定[13]抑菌谱测定：采用平板对峙法[10]，于PDA平板中央分别接种8种供试病原真菌菌饼(D=0.5 cm)，与其等距离(2.5 cm)处点接拮抗菌株，以点接无菌NA培养液为对照，于28℃培养箱中培养，待对照指示菌满皿后量取待测菌落直径，计算抑菌率。

固氮能力测定：将待测菌株用划线法接于阿须贝培养基上，以接无菌水为对照，28℃培养，在第3和7 d检查其生长情况，在培养基上明显生长者记为阳性，继代培养3代仍为阳性，则认为具有固氮能力。

2.2和肽素水平随心功能分级增高依次加大,心功能II、III级和IV级患者的和肽素含量均显著高于未发生心衰患者及心功能I级患者(P<0.05)

溶磷能力测定：将待测菌株分别点接在PKO和孟金娜平板培养基上，同时，用无菌水点接作为对照，28℃培养3～5 d，菌落周围出现透亮溶磷圈的记录为阳性，否则为阴性。

产IAA能力测定：采用Salkowski法筛选具有产植物生长激素能力的内生细菌。将待测菌株接于King培养液中，置于28℃，120 rpm摇床中连续培养12 d。取菌液0.05 mL滴于白色陶瓷板上，并加入等量比色液。以加0.05 mL IAA的比色液作对照；在室温下10～15 min内目测其颜色变化，红色为阳性，其它为阴性。

以上处理与对照均3次重复。

1.3 菌株鉴定

形态观察：采用划线法将所筛选的拮抗菌株接于NA培养基上，于28℃恒温箱中培养3 d后，观察菌落的形态特征并描述；将培养12 h后的新鲜菌体进行革兰氏染色[14]，拍照。

生理生化测定：碳源利用试验、甲基红试验、V-P试验、硝酸盐还原试验、精氨酸双水解酶试验、接触酶试验、氧化酶试验、产吲哚试验、产H2S试验、果聚糖产生试验、糖、醇类发酵试验、明胶液化、淀粉水解、Tween80水解、运动性试验，相关培养基配方与试验方法参考方中达[14]和东秀株等[15]的方法。

16S rDNA与gyrB基因序列鉴定：采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株DNA。16S rDNA与gyrB的扩增分别利用引物27F/1492R[16]和UP-1/UP-2[11]。16S rDNA的PCR扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环30次；再在72℃延伸8 min，4℃保存。扩增反应体系总体积为50 μl，其中2×PowerTaqMixture 25 μl，27 F 2 μl，1492 R 2 μl，Target DNA 1 μl，ddH2O 20 μl。gyrB的扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性1min，5℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增体系中引物为UP-1/UP-2，其它同16S rDNA。后经凝胶电泳检测将有特异性条带的扩增产物送生工生物(上海)有限公司进行测序。将测定的序列在GenBank中与已知序列进行Blast同源性比对分析，并用Mega(7.0)软件进行多重序列比较，用邻接法构建系统发育树，明确拮抗菌株的系统发育学地位。

1.4 室内盆栽对番茄丁香假单胞叶斑病防效

将拮抗菌株和番茄丁香假单胞叶斑病分别经NA摇瓶液体培养24 h后，先将病原菌通过伤口接种法接种于健康的番茄植株叶片上，24 h后接种生防菌菌悬液，保湿24 h后在室内条件下待其发病，10 d后观察发病情况，计算发病率、病情指数及生防菌对番茄叶斑病的相对防治效果。

1.5 数据处理

利用Excel 2010和SPSS19.0等软件进行试验设计与数据处理。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株筛选

从供试内生细菌中筛选出10株有明显抑菌带的拮抗细菌，其抑菌圈直径介于0.75～1.22 cm，抑菌带宽介于0.20～0.65 cm，经复筛对拮抗效果较强且稳定的菌株261MY6进行后续研究(图1)。

图1 生防菌株261MY6的筛选Fig.1 Screening of antagonistic strain 261MY6

2.2 抑菌谱测定

结果表明，菌株261MY6对马铃薯炭疽病病菌、番茄灰霉病病菌、小麦根腐病病菌、马铃薯褐腐病病菌、孜然根腐病菌、黄瓜枯萎病菌、马铃薯枯萎病菌和番瓜根腐病菌的抑制率均在50%以上，其中对马铃薯褐腐病菌抑制率高达96.10% (表1、图2)。

表1 261MY6的抑菌谱测定Table 1 The inhibition rate of antagonistic strains against pathogenic fungi

图2 拮抗菌株的抑菌谱测定Fig.2 Antagonistic strains confront eight kinds of pathogenic fungi photos注：1:马铃薯枯萎病菌; 2:孜然根腐病菌; 3:小麦根腐病菌; 4:马铃薯褐腐病菌; 5:马铃薯炭疽病菌; 6:黄瓜枯萎病菌; 7:番茄灰霉病菌; 8:番瓜根腐病菌。A1至A8为处理Note：1:F. avenaceum; 2: F. Solani; 3: B. sorokiniana; 4: S. stemonitis; 5: C. coccodes; 6: F. oxysporum; 7: B. cinerea; 8: Fusarium sp. A1 to A8 for processed

2.3 生物功能测定

2.3.1固氮能力测定 菌株261MY6在无氮阿须贝培养基上能生长，且在7 d后连续培养的3代也能在无氮培养基上形成明显的菌落，说明菌株261MY6具有稳定的固氮作用。

2.3.2溶磷能力测定 溶磷能力采用溶磷圈法，在PKO培养基上菌株261MY6周围有溶磷圈(图3)，孟金娜培养基上无溶磷圈，表明菌株261MY6只能溶解无机磷。

图3 溶磷能力定性测定Fig.3 Phosphorus-solubilizing capacity determination of antagonistic strain 261MY6

2.3.3产IAA能力测定 含色氨酸和不含色氨酸的培养液中分别加入比色液，菌株261MY6在陶瓷板上均变色，表现为淡红色和血红色的阳性反应，说明菌株261MY6有产IAA的能力(图4)。

图4 产IAA能力的定性测定Fig.4 IAA-producing capacity determination of the antagonistic strain 264ZY7注：A:CK+PC (不含色氨酸); B: CK+PC (含色氨酸);C: 261MY6+PC (不含色氨酸)； D: 261MY6+PC (含色氨酸)。Note: A:CK+PC (No Tryptophan); B: CK+PC (Tryptophan);C: 261MY6+PC (No Tryptophan)；D: 261MY6+PC (Tryptophan)。

2.4 拮抗菌株的鉴定

2.4.1形态学观察 菌株261MY6菌落呈圆形，中央稍陷，乳白色，不透明，菌落大小约为2 mm，菌体呈短杆状，革兰氏染色阳性，0.61×1.61 μm～0.71×2.04 μm (图5)。

图5 菌株261MY6的菌落形态和革兰氏染色Fig.5 The colony morphology and gram staining of antagonistic strain 261MY6

2.4.2生理生化测定 由表2知，菌株261MY6甲基红试验为阴性，V-P测定为阳性，能够还原硝酸盐，精氨酸双水解酶和氧化酶反应为阴性，接触酶、淀粉水解和Tween 80水解试验均为阳性反应，具有产吲哚和H2S的能力，明胶液化为阳性，能利用L-阿拉伯糖、甘露糖、山梨糖、乙醇和甘露醇等多种糖、醇类进行发酵产酸，对苹果酸、乳酸和丙酸的利用为阳性。

表2 菌株261MY6生理生化特性测定Table 2 Determination of physiological and biochemical characteristics of antagonistic strain 261MY6

2.4.3基因序列分析鉴定 1)菌株261MY6的16S rDNA基因为1194个碱基，其基因序列与GenBank中已知序列进行Blast同源性比对与解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens(KC692163.1，MH934926.1)的相似度较高。经建立系统发育树，菌株261MY6与解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens(KC692163.1，MH934926.1)聚在一起(图6)。因此，初步将其鉴定为解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens。

2)菌株261MY6的gyrB基因为595个碱基，其基因序列在GenBank中与已知序列进行Blast同源性比对，与解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens(KT265087.1)的相似度较高。经建立系统发育树，菌株261MY6与解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens(KT265087.1)聚在一起(图7)，结合形态学特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析，将菌株261MY6鉴定为解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens。

图6 菌株261MY6 16SrDNA系统发育树Fig.6 6S rDNA phylogenetic tree of antagonistic strain 261MY6

图7 菌株261MY6 gyrB系统发育树Fig.7 gyrB phylogenetic tree of antagonistic strain 261MY6

2.5 室内盆栽对番茄丁香假单胞叶斑病的防效

经盆栽试验，菌株261MY6接种10 d后，发病率为58.18%，病情指数为21.82，对照组发病率和病情指数分别为94.38%和55.06，对番茄丁香假单胞叶斑病的防效为68.71%，说明该菌株对番茄叶斑病表现出较好的防治效果，具备良好的开发潜力。

3 讨论与结论

内生细菌在寄主植物体内不易受外界环境条件的影响，且能长期稳定繁殖，安全性高，利用其防治植物病害有得天独厚的优势。为实现新时代生态文明建设，全面推动绿色发展，越来越多专家学者对有巨大开发潜力的有益内生细菌开始研究和开发，裴淑兰等[18]报道野生酸枣内生菌中对梨黑斑病菌和黄瓜枯萎病菌有拮抗作用；乔俊卿等[19]报道枯草芽孢杆菌Bs916对番茄青枯病具有较好的防病效果。本试验从高寒草甸牧草中分离筛选到一株对病原细菌和真菌都具有良好拮抗作用的内生细菌261MY6，经分子生物学16S rDNA和gyrB基因序列相似性分析，并结合形态学、生理生化特性将菌株261MY6鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillusamyloliquefaciens。芽胞杆菌是自然界分布广泛的一种生防细菌，因具有超强的繁殖力，稳定的理化性质，广泛的抑菌谱，在科研和生产中应用较多，谯天敏等[20]报道解淀粉芽孢杆菌能够有效定殖于山茶叶片表面及内部，且对山茶灰斑病具有显著的生物防治效果；杨晓云等[21]报道解淀粉芽孢杆菌B1619对设施番茄土传病害具有良好防治效果。本试验中，菌株261MY6对马铃薯炭疽病菌、马铃薯褐腐病菌、马铃薯枯萎病菌、番茄灰霉病菌、小麦根腐病菌、孜然根腐病菌、黄瓜枯萎病菌和番瓜根腐病菌的抑制率均在50%以上，其中对马铃薯褐腐病菌抑制率高达96.10%。室内盆栽对番茄丁香假单胞叶斑病的防效达68.71%，说明该生防细菌具备良好的开发潜力，但菌株261MY6的作用机理及发酵条件还需进一步探讨。