马丹，周淑芬，张珺，朱颖军

(1天津医科大学中心妇产科临床学院，天津300070；2天津市第三中心医院)

人乳头瘤病毒(HPV)是一种双链环状DNA病毒，属乳多空病毒科，具有较强的宿主特异性，主要感染人黏膜上皮[1]。根据致癌风险，可分为低危型HPV与高危型HPV(HR-HPV)[2]，最常见HR-HPV亚型为HPV16、HPV18[3]。免疫功能异常在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用[4]。Th17、Treg均属CD4+T细胞亚群，介导细胞因子发挥不同免疫效应，二者存在动态平衡，分别分泌白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素23(IL-23)、白细胞介素6(IL-6)、转化生长因子β(TGF-β)等细胞因子[5]。有研究表明Th17/Treg失衡在宫颈感染中发挥重要作用[6]。本研究拟通过检测阴道微环境中免疫相关细胞因子IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平变化，初步探讨细胞因子在宫颈HR-HPV感染中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年9月～2017年6月在天津医科大学中心妇产科临床学院就诊的女性患者92例，均有HR-HPV持续感染史。纳入标准：有性生活史；非月经期。排除标准：妊娠期；检查前1周内阴道用药；合并非宫颈组织的其他恶性肿瘤；半年内曾使用糖皮质激素、免疫调节剂；有盆腔放化疗史。根据组织病理检查结果及参考《实用妇科肿瘤学》[7]将患者分为CIN Ⅰ级30例(A组)、CIN Ⅱ、Ⅲ级32例(B组)、宫颈癌30例(C组)。A组年龄25～50(34.62±8.11)岁，感染HPV16型12例、HPV18型10例、其他型8例。B组年龄26～52(35.16±7.62)岁，感染HPV16型13例、HPV18型12例、其他型7例。C组年龄27～51(34.27±7.38)岁，感染HPV16型10例、HPV18型11例、其他型9例。三组年龄、感染类型具有可比性。另同期选取体检健康女性31例为对照组，经液基薄层细胞检测宫颈无异常，年龄23～50(32.67±5.17)岁。各组年龄具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患者均知情并签署手术同意书。

1.2 HR-HPV负荷量检测 各组自行清洗外阴，宫颈活检前用5 mL生理盐水冲洗宫颈及阴道上1/3，停留10 s后于后穹隆吸出灌洗液4～4.5 mL，室温2 000 r/min离心5 min，吸取上清液于-80 ℃冷冻保存，用宫颈刷收集脱落细胞于-4 ℃保存。取宫颈脱落细胞，采用杂交捕获2代基因杂交信号放大系统进行检测，相关仪器设备与试剂购自美国Digene公司。

1.3 阴道微环境中细胞因子水平检测 取灌洗上清液冰上解冻，恢复室温后采用ELISA法检测IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平。IL-17检测试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司，IL-23检测试剂盒购自北京百奥莱博生物科技有限公司，IL-6检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司，TGF-β检测试剂盒购自上海基免生物科技有限公司。严格参照试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 各组HR-HPV感染患者病毒负荷量分布比较 三组HR-HPV负荷量分布比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组HR-HPV负荷量比较[例(%)]

2.2 四组阴道微环境中细胞因子水平比较 四组阴道微环境中细胞因子水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，B组、C组IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平及IL-17/IL-6值高(P均<0.05)，A组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与A组比较，B组、C组IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平及IL-17/IL-6值高(P均<0.05)；与B组比较，C组IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平及IL-17/IL-6值高(P均<0.05)。见表2。

表2 四组阴道微环境中细胞因子水平比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与A组比较，bP<0.05；与B组比较，cP<0.05。

2.3 不同亚型感染患者阴道微环境中细胞因子水平比较 不同HR-HPV亚型感染患者阴道微环境中细胞因子水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同亚型感染患者阴道微环境中细胞因子水平比较

2.4 HR-HPV感染患者阴道微环境中免疫细胞因子水平与HR-HPV负荷量的相关性 Spearman相关分析结果显示，IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平与HR-HPV负荷量均呈正相关(rs分别为0.612、0.513、0.597、0.519，P均<0.05)。

2.5 宫颈HR-HPV感染的影响因素 将宫颈是否感染HR-HPV作为因变量，以IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β均为宫颈HR-HPV感染的影响因素。见表4。

表4 宫颈HR-HPV感染的影响因素多元回归分析

2.6 阴道微环境中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β联合检测对宫颈HR-HPV感染的预测价值 绘制ROC曲线，阴道微环境中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β联合检测预测HR-HPV感染的ROC曲线下面积为0.731，特异度为81.2%，敏感度为76.3%。

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来有年轻化的趋势。HR-HPV感染是CIN及宫颈癌的主要致病因素[8]。HPV感染可使上皮细胞获得较高的增殖活性，也可通过促进上皮细胞的增殖而癌变[9]，是人类癌症发病过程中惟一确定的致癌病毒。多数妇女曾感染过HPV，大部分可经免疫系统自行消除，但一旦免疫系统出现问题无法消除，导致宫颈病变甚至发生宫颈癌[10]。有研究表明，HR-HPV负荷量与宫颈病变程度有关，HR-HPV负荷量越高，宫颈病变加重的危险越大[11]。因此，避免HR-HPV感染是降低宫颈癌发病率的关键。

有研究表明，免疫系统在宫颈HR-HPV感染中发挥重要作用，CD4+T细胞亚群接受抗原刺激后，增殖、分化为各种效应细胞，分泌细胞因子，参与各个阶段的免疫应答[12]。正常机体CD4+T细胞亚群除Th1、Th2外，还包括Th17与Treg。Th17主要分泌IL-17、IL-23。Treg被认为是一种独立的CD4+T细胞亚群，主要功能是抑制其他T细胞的活化[13]。有研究表明，Treg细胞可通过发挥免疫抑制作用而参与HPV病毒的免疫逃逸[14]。Treg细胞可分泌细胞因子IL-10和TGF-β。Th17及Treg细胞来源于相同的Th0，在特定细胞因子调控下相互排斥，向不同的方向分化[15]。但有关IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β在阴道灌洗液中的水平及其与宫颈HR-HPV感染的关系研究甚少。

徐静等[16]研究中HR-HPV负载量随CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ级别依次增加，认为HPV负荷量可促进宫颈逐步发生病变。本研究随着病情加重，HR-HPV负荷量大于1 000 copies/mL的人数逐渐增多，而小于100 copies/mL的人数逐渐减少，表明HR-HPV负荷量越大病情越重，与相关研究一致。何芳等[17]研究表明，Th17细胞、Treg细胞水平与宫颈癌临床分期、淋巴结转移、脉管浸润有关，表明Th17、Treg细胞均与宫颈癌发生发展密切相关。本研究中，宫颈病变患者阴道微环境中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平高于对照组，且随病情加重，IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平升高，推测IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β可能参与了宫颈病变发生发展及恶性转化。与宫颈正常者比较，宫颈癌患者IL-17/IL-6值升高，因此猜测Th17/Treg在升高的同时向Th17偏移，形成Th17优势；而"Th17优势"是造成宫颈HPV感染的重要原因之一。本研究在不同HR-HPV感染亚型中，IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平差异无统计学意义，可能是因为感染亚型种类多，而样本量小，无法体现差异。Spearman相关性分析显示，IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β均与HR-HPV负载量呈正相关，提示HPV感染会造成细胞免疫因子IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平升高，进一步导致患者免疫功能下降，使机体更易受到病毒袭击。同时采用Logistic回归分析结果显示IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平升高是宫颈HR-HPV感染的独立危险因素。ROC曲线分析结果显示四者联合检测，曲线下面积为0.731，敏感度、特异度良好，对宫颈HR-HPV感染具有预测价值，有望成为预测宫颈HR-HPV感染的重要指标。

综上所述，颈HR-HPV感染患者阴道微环境中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平升高，四者联合检测可预测宫颈HR-HPV感染。由于本研究样本数较少，结果有可能产生偏倚，将来需扩大样本对研究结果加以证实。