周婷婷

在《中国药典》2015年版一部中记载的临床常用乌头类中药包括：毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaeli)的干燥母根，草乌为毛茛科植物乌头、北乌头等多属植物的块根，附子为毛茛科植物乌头的子根的加工品及其多种炮制加工品[1]。三者均为国家法定品种，是有毒中药大毒、有毒、小毒的代表[2]。乌头类中药在我国已有2000多年的应用历史，国内外的研究报道也较多，主要集中在酯型生物碱成分的含量测定和药理毒理上[3-6]，但对于其蛋白质的化学研究鲜有报道。

近年来，随着人们对蛋白质、多肽物质的认识，发现蛋白质除了作为人体的必需生命物质以外，还有一些特殊的药理作用[7-9]。同时现代药理研究发现中草药中的氨基酸往往是治疗疾病的主要有效成分或辅助成分[10-12]。由于乌头类中药中蛋白质的含量也较高，而且在临床常用溶媒（水和酒）中的溶解度也较高。因此，本论文以酸水解得到氨基酸为指标进行分析，以氨基酸的种类和含量对乌头类药材进行对比研究，旨在找出它们三者在氨基酸组成方面的差异，为乌头类药材的现代研究提供一定的参考。

1 实验材料

1.1 药材来源

生川乌、生附子（均采自四川江油附子GAP基地），生川乌购买于四川省中药材公司，经成都中医药大学生药教研室李敏教授鉴定，均为正品。

1.2 主要仪器

日立L-8800型氨基酸自动分析仪（ASM自动数据处理器）；DGG-9240A 电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器厂）；Satorius BP211D电子分析天平（万分之一）；Waters水解工作台；BUG超声波清洗仪（上海森信仪器厂）；HGC-12氮吹仪（上海泉岛科贸有限公司）；pH S-2型酸度计（上海雷磁仪厂）等。

1.3 试剂

乙醇、茚三酮、氢氧化钡、硫酸铵、盐酸等试剂均为分析纯，氨基酸对照品（日立提供配套分析用）。实验室水为重蒸水。

2 实验方法

2.1 样品处理

将川乌、草乌、生附子分别粉碎为细粉（过60目筛），精密称量川乌、草乌、生附子粉末各50.5 mg、50.1 mg、49.8 mg。将粉末置于特制的玻璃水解管中真空干燥后，加入6.0 mol/L HCl溶液，将试管置于反应器中，超声脱气10 min，再抽至真空并充入氮气反复3次后110 ℃恒温24 h进行酸水解。将酸水解的样品溶液减压干燥（-0.7 Mpa，70 ℃），由于仪器要求，用0.1 mol/L的HCl溶液溶解并定容于5 mL量瓶中，用0.45 μm滤膜过滤。分别进样20 μL进行实验。

2.2 测定条件

离子交换柱：柱长4.6*60 mm，树脂2622#，反应柱柱温135 ℃；分离柱柱温 57 ℃。缓冲液：流速0.40mL/min；柱压7.00～7.30 Mpa；茚三酮：流速0.35 mL/min，柱压0.70～0.80 Mpa。采用标准蛋白分析程序。

2.3 分析数据

ASM水解蛋白标准分析法。

2.4 数据处理

ASM自动数据处理器。

3 实验结果

3.1 种类差别

采用氨基酸自动分析仪测定了乌头类药材中氨基酸组分，发现经过酸水解的草乌、川乌、生附子水解样品液中均能够检测出16种氨基酸，而且3种样品中都没有检测出脯氨酸。从实验结果来看氨基酸峰的数目基本一致，而且其他未检测的杂质峰的保留时间也仅仅是个别差异，这就说明了草乌、川乌、生附子的氨基酸、蛋白质、多肽的组成极为相似。

3.2 量的差别

整体上水解氨基酸的总量是生附子＞生草乌＞生川乌，生草乌与生川乌水解氨基酸的含量比较接近。在个体上生附子绝大多数水解氨基酸的含量较高，这也提示其蛋白质相对较多。所含氨基酸中以谷氨酸含量最高，生附子中为106.5370 nmol/50g生药，生草乌中为97.4868 nmol/50g生药，生川乌中为38.1867 nmol/50g生药。但是精氨酸的含量在川乌中的含量比生附子高，而生川乌的缬氨酸含量与生附子和生草乌相差巨大，有可能是其对应蛋白质的含量极小造成的，详细结果见表1。

通过测定，可以看出草乌、川乌、生附样品中含有人体必需的氨基酸：赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸，其必需氨基酸的总量是生附子＞生草乌＞生川乌，与氨基酸含量规律一致。

表1 草乌、川乌、生附样品中含各类氨基酸的量(nmol/50g生药)

4 讨论

氨基酸分析技术在生命科学、食品科学、中医药学等领域研究中都起着至关重要的作用。近年来，人们越来越重视氨基酸分析方法的革新和改进，氨基酸分析的速度、灵敏度、仪器自动化水平提高至一个崭新的水平，使氨基酸分析方法发展成为一种具有广泛适应性的分析方法。实验中选择全自动氨基酸分析仪对氨基酸进行测定，是利用样品中氨基酸组分的结构不同、酸碱性、极性及分子大小不同，在阳离子交换柱上将它们分离，采用不同pH值离子浓度的缓冲液将各氨基酸组分依次洗脱下来，再逐个以另一流路的茚三酮试剂混合，然后共同流至螺旋反应管中，于一定温度下进行显色反应，形成在570nm有最大吸收的蓝紫色产物。该方法操作步骤简单，氨基酸不用柱前衍生，直接上样进行分析，故是迄今氨基酸定性、定量分析中应用最广泛的方法之一。同时该方法也是目前多种中药中氨基酸测定的常用方法[13-15]。

乌头类中药通过酸水解后进行氨基酸分析尚未有文献报道，我们在水解过程中经过反复尝试发现：在水解之前必须要将样品中和酸水中的空气排除完全后再吹入氮气，否则残留的空气会氧化含有羟基的氨基酸，如苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸，使之无法检出。

因为水解氨基酸需要6.0 mol/L HCl溶液对药材进行长时间的高温作用，会对药材产生类似炮制加工的作用，所以在实验中仅选用生品进行分析比较。在衍生步骤中我们前期通过考察茚三酮法、OPA法、PTC-AA法，最后采用灵敏度高、简便可靠的茚三酮法。但是茚三酮试剂必须在避光的真空环境中进行储存。

传统乌头类药材常以水煎入药，长期以来研究者们重点关注的都是生物碱类成分，而总生物碱的含量在该类药材中的含量不到1%[16]。水煎液中含有大量的大极性成分，近年来关于其水溶性成分多糖的研究日益增多[17-18]，而对另一类活性物质蛋白质、氨基酸类成分关注甚少。通过本实验的研究发现，乌头类药材中含有丰富的蛋白质、多肽和氨基酸类成分，且附子中含量更为丰富，这与植物代谢过程中的积累程度有着密切的关系。同时，通过本实验研究，也填补了乌头类药材氨基酸类成分研究的空白，为乌头类药材的现代研究提供一定的参考。