武海燕，张灵莉，冯雪梅

锁阳，性甘，温，归肝，肾，大肠经。具有补肾阳，益精血，润肠通便的作用。可用于治疗肾阳不足，精血亏虚，腰膝痿软，阳痿滑精，肠燥便秘等病症[1]。明代《本草纲目》记载:“锁阳性温，补肾，益精血，润燥养精治痿弱”。《本草原始》: “锁阳补阴血，祛虚火，兴阳固精，强阳易髓”。《中药志》:“补肾，滑肠，强腰膝，主治男子阳痿。”现代药理学研究表明，锁阳含有含有糖和糖苷类、黄酮类、萜类、甾体类等多种化学成分，具有增强性功能、增强机体免疫力、抗氧化等药理作用[2～3]。本实验通过体外培养成骨细胞加入锁阳含药血清进行干预，观察其对成骨作用的影响，为锁阳与骨形成发育的关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

体重18～22 g 的SPF级昆明小鼠64只，（实验动物许可证号：SCXK(川)2015-030）雌雄各半，随机分为四组，每组16只，分别为生理盐水对照组，锁阳含药血清低、中、高剂量组。

1.2 药物及其制备

本实验所用中药锁阳购自同仁堂大药房。根据预实验，本实验药物高剂量组浓度设置为0.9 g．mL-1。称取90 g锁阳，煎至100 mL，使其最终药物浓度为0.9 g．mL-1，此为高剂量组药物浓度，采取倍比稀释法分别稀释适量为0.45、0.225 g．mL-1，分别为中剂量组与低剂量组灌胃浓度。

1.3 主要试剂与仪器

CCK8试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，批号：#L21114)，碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒(南京建成科技有限公司，批号：20180124)，0.2%茜素红染色试剂盒(北京Solarbio公司，批号：20171127)，倒置相差显微镜(日本 Olympus,型号：CK40-F200)，细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司，型号：IC1000)，二氧化碳培养箱(日本SANYO，型号：MCO-15AC)，全波长酶标仪(美国Thermo公司，型号：Varioskan),超净工作台(苏州净化厂，型号：SWCJ-2F)。

1.4 方法

1.4.1 含药血清制备 根据每只小鼠体重分别灌胃各组小鼠相应浓度的锁阳水煎液(0.1 mL/10 g)，每天一次，连续灌胃两周(14天)，并于最后一次灌胃2h后摘眼球取血，静置半小时，3500 rpm．min-1离心15min后立即于超净工作台中操作，将同组血清混合，过0.22 μm滤膜除菌后于56℃恒温水浴锅中补体灭活30 min，将每组血清各自分装为1mL/支，-20℃冰箱中保存备用。

1.4.2 成骨细胞来源与培养…成骨细胞株MC3T3-E1Subclone 14来源于小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14，细胞培养基为含10%胎牛血清，1%双抗的α-MEM培养基。细胞长满至瓶底80%时，弃去旧培养基，PBS冲洗后用胰酶消化至变圆时，立刻加入等量培养基终止消化，并根据细胞情况按合适的传代比例进行传代。

1.4.3 实验分组 将成骨细胞分为四组，分别为生理盐水血清组，锁阳含药血清低剂量组，含药血清中剂量组及含药血清高剂量组，每组的培养基中分别含有10%对应组血清，不含胎牛血清，生理盐水血清组培养基为含10%灌胃生理盐水小鼠的血清。

1.4.4 成骨细胞增殖检测…取生长情况良好的第三代成骨细胞，以2×103个/100 μL每孔的细胞密度接种于96孔板，每组平行设置6个复孔，24h后换为分别含10%浓度的锁阳含药血清低、中、高剂量的培养液继续培养成骨细胞，对照组则换为含10%生理盐水组血清的培养液。分别继续培养24、48、72 h后弃去旧培养液，每孔加100 μL不含血清的α-MEM培养基、10 μLCCK8试剂， 37℃、含5%的CO2培养箱培养继续培养4 h，于酶标仪450 nm处检测其OD值。

1.4.5 成骨细胞碱性磷酸酶活性检测…取对数生长期的成骨细胞以5×103 个/100 μL/孔的细胞密度接种于12孔板中，每组平行设置3个复孔，24 h后将培养液换为不同浓度的锁阳含药血清培养基进行培养，对照组加等量生理盐水组血清，期间每隔两天换液一次，培养七天后进行钙钴法染色，并于倒置显微镜下观察染色结果，测定其成骨细胞的ALP活性。

1.4.6 成骨细胞矿化结节染色…取长势良好的成骨细胞用胰酶消化后，以5×103 个/500 μL/孔的细胞密度铺12板，每组平行设置三复孔，24 h后更换终浓度为含10 mM的β-甘油磷酸钠与50 mg．L-1抗坏血酸的诱导培养基进行培养，以后每隔2～3天换液一次，换液时动作要轻柔，避免细胞脱离瓶底。连续培养14天后进行茜素红染色，观察染色结果。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，实验数据计算采用均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析法(ANOVA)，组间比较采用t检验，以p＜0.01为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 成骨细胞增殖情况(CCK8法)

在24，48，72 h三个时间点，锁阳含药血清各组增殖均高于生理盐水血清组，差异具有统计学意义(P＜ 0.05)。其中锁阳含药血清中剂量组与高剂量组在三个时间点的增殖程度与生理盐水血清组相比，差异均具有显著性意义(P ＜ 0.01)；而锁阳含药血清低剂量组在48 h，72 h两个时间点与生理盐水血清组比较，差异不具有显著性意义。(P ＞0.01) (Fig.1)

Fig.1锁阳含药血清对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响(x±s,n=6)

2.2 成骨细胞ALP活性检测(钙钴法)

钙钴法染色后，胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状、条状沉淀。如图示，成骨细胞分泌ALP的含量随着锁阳含药血清浓度增加呈现递增趋势，而生理盐水血清组分泌的ALP明显少于药物血清组。(图2)

图2 不同浓度锁阳含药血清对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶染色结果(10×20)

2.3 成骨细胞茜素红染色

经0.2%茜素红染液染色后，钙沉积物呈橙红色。如图示，锁阳含药血清高剂量组的钙化结节较其他两组更多，分布更加广泛。而生理盐水血清组的钙化结节颜色较浅，数量最少。(图3)

图3 不同浓度锁阳含药血清对MC3T3-E1细胞茜素红染色(10×20)

3 讨论

锁阳是一味传统补肾中药，具有补肾阳，益精血的作用。祖国医学认为，肾主骨生髓，故认为补肾类中药与骨的形成发育或骨类疾病有密切的关系。张霞等[4]发现，锁阳80%乙醇提取物可以对去卵巢致大鼠的骨质疏松产生明显的预防作用；史平等[5]发现，40 mg．kg-1的锁阳多糖可逆转血清BGP及尿液DPD含量，其类雌激素样作用使其具有防治骨质疏松的作用；冯方[6]用锁阳提取液干预激素性股骨头坏死兔模型8周后，发现其能促进股骨头坏死情况的好转；本实验通过锁阳含药血清干预成骨细胞，旨在从成骨细胞角度观察锁阳与骨形成发育的相关性。

MC3T3-E1是来源于小鼠颅顶的成骨细胞株，其与体内成骨活性很相似，在抗坏血酸和3-4mM无机磷酸盐中生长表现出高水平的细胞分化，是研究成骨细胞很好的细胞模型[7～8]。本实验采用操作更简便，更精确的CCK8法[9]检测MC3T3-E1细胞增殖，发现在24，48，72 h三个时间点，与生理盐水血清组比较，锁阳含药血清组能够不同程度的促进MC3T3-E1的增殖，且有一定的浓度依赖性，锁阳含药血清浓度越高，细胞增殖越多。

成骨细胞富含碱性磷酸酶(ALP)，其是主要分布于细胞膜的钙结合转运蛋白，具有促进细胞成熟、钙化的作用，其活性可作为评价成骨细胞分化程度的良好指标[10]。成骨细胞有体外矿化特征，矿化结节形成是成骨细胞骨形成功能的表现[11]。本实验结果表明，不同浓度的锁阳含药血清能够不同程度的促进体外成骨细胞增殖分化以及矿化，且在一定浓度范围内，浓度越高，促进作用越明显，提示锁阳可能通过促进成骨细胞增殖分化与钙化干预骨形成。

补肾中药主要通过BMP-Smads、Wnt/β-catenin等信号通路促进成骨细胞的作用，进而促进骨形成过程[12]。Zhang JF等[13]发现，淫羊藿可通过BMP和Wnt /β-连环蛋白信号传导途径对成骨分化起促进作用，Tang DZ等[14]证明补骨脂素可上调BMP2和BMP4基因表达量，增加BMP报告基因12xSBE-OC-Luc的活性，同时增强了BMP信号传导的直接靶基因Osx的表达，进而促进成骨细胞分化。本实验初步观察得到锁阳含药血清可以促进成骨细胞增殖分化，具体经由BMP信号通路还是Wnt/β-catenin等其他信号通路途径发挥作用，还需进一步研究。