宫颈癌是严重威胁女性健康的第二大恶性肿瘤,是目前世界范围内具有高发病率和高死亡率的生殖系统的疾病。宫颈癌主要发生在老年女性,五年生存率极低,宫颈癌复发病人的生存期仅为1～2年[1]。文献报道,高度保守的真核细胞真核翻译起始因子5A(eIF5A)基因与癌症发生机制密切相关。在所有哺乳动物细胞中,eIF5A-1基因呈现显著高表达,在增殖细胞中eIF5A-1表达更为丰富[2]。本研究通过构建eIF5A-1过表达和沉默表达质粒载体作用SiHa细胞,观察eIF5A-1在宫颈癌细胞生物学特征改变过程中的功能及作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料收集 选取2015年6月至2016年10月在青岛大学医学院附属医院就治的宫颈癌病人40例,宫颈组织病理诊断明确。宫颈癌病人临床资料收集完整无误。将宫颈癌病人分为老年组和非老年组,其中老年组18例,年龄62～69岁,平均(66.1±3.2)岁,非老年组22例,年龄27～58岁,平均(42.1±7.1)岁。每例对象均收集癌组织及对应癌旁正常组织,取材后置于-79 ℃低温保存备用。

1.2 细胞培养 宫颈癌细胞株SiHa由中国典型物种保藏中心提供。细胞接种在DMEM培养基中(包含小牛血清20%、链霉素100μg/mL、庆大霉素100 U/mL以及非必需氨基酸10 mL/L)。宫颈癌细胞培养及体外实验在37 ℃,5% CO2的培养箱内进行。

1.3 免疫印迹 取一定体积的宫颈癌组织及癌旁正常组织,分别加入5倍体积的组织裂解液,移液器反复吹打成糊状,促使蛋白析出。取蛋白质标本与2×loading buffer混匀,100 ℃,20 min后,10 000 r/min,离心15 min;取上清样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE);电泳结束后,进行电转移至偏二氟乙烯膜(PVDF);加入5%脱脂奶粉稀释的eIF5A-1一抗,37 ℃孵育4 h,以TBS洗涤PVDF膜,每次15 min,洗涤3次,加入HRP连接的二抗,37 ℃孵育1 h后,加入显色液,避光反应6～12 min后,曝光20 s;Bio-Rad凝胶成像分析仪对免疫印迹条带进行灰度计算,以下列公式进行计算:目的蛋白/内参蛋白。

1.4 构建eIF5A-1 siRNA质粒载体 siRNA构建采用pGenesil-1质粒作为载体,BamHⅠ+HindⅢ进行双酶切后,采用1%琼脂糖凝胶进行大分子片段回收。pGenesil-1线性化后与合成的eIF5A-1 siRNA(序列为:5′-AAC GGA ATG ACT TCC AGC TGA-3′)(随机选取一段与目的基因无关序列作为Negative siRNA),在22 ℃水浴中,与T4DNA连接酶反应24 h;取连接产物6 μL转化至DH5α感受态细胞,均匀涂布LB平板上(含20μg/mL Kanar抗性),37 ℃,24 h;挑取阳性单克隆菌落5个,转接于LB培养液中,37 ℃,400 r/min摇床,24 h;提取质粒后,SalⅠ进行酶切,1%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定;将筛选出的阳性克隆质粒由武汉晶赛生物工程技术有限公司进行DNA序列分析,证实pGenesil-1质粒中正确插入目的eIF5A-1基因片段,本研究中,重组质粒命名分别为eIF5A-1 siRNA和Negative siRNA。

1.5 构建eIF5A-1 vector质粒载体 将BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点加入eIF5A-1引物序列中,eIF5A-1引物与探针的设计,其上游序列为:Primer-F (5′-AAC ATA TGT CCG ATG ATG AGG GAA A-3′)和Primer-R (5′-AAG GAT CCT TAC TTT TCA ACA GCA TTT TTA-3′)。本研究中反应体系如下:0.2μg DNA模板,0.1μg质粒载体,加ddH2O至7.2μL,45 ℃孵育8 min,冷却0 ℃。加入10 ng cDNA、100 ng质粒载体、1μL T4DNA连接酶,以ddH2O定容至10μL,26 ℃,2 h,构建重组eIF5A-1 vector。充分混匀后,10 000 r/min,离心15 min, 12 ℃,24 h,置于-20 ℃保存备用,重组质粒分别命名为eIF5A-1 vector和Empty eIF5A-1 vector。

1.6 宫颈癌细胞活力的检测 分别将构建的Negative siRNA、eIF5A siRNA、Empty vector和eIF5A vector转染宫颈癌细胞,培养48 h后,采用甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测SiHa细胞活力,实验步骤如下。用0.25%胰蛋白酶消化细胞10 min后,用完全营养液终止消化,调整细胞密度为1000～10 000个/孔,接种到96孔板,每孔200μL;继续培养48 h后,加入0.5% MTT溶液20μL,培养4 h后,弃去上清。加DMSO溶液200μL,充分震荡20 min,使形成的结晶物甲躜彻底溶解,于490 nm波长处,酶标仪读取各孔OD值。

1.7 宫颈癌SiHa细胞增殖的测定 分别将构建的Negative siRNA、eIF5A-1siRNA、Empty vector和eIF5A-1 vector转染宫颈癌细胞,培养48 h后,采用3H-胸腺嘧啶核苷酸(3H-TdR)掺入法检测SiHa的增殖能力。首先加入0.5～1μci3H-TdR 50μL继续培养12～18 h。收集细胞后,10 000 r/min,离心15 min,弃去上清,冷PBS充分洗涤3次,用三氯乙酸、无水乙醇进行充分抽干转移置玻璃纤维滤纸上的细胞膜片,烘干后,剪滤纸片,将膜放入8 mL闪烁液中,暗视野,室温放置25 min,用Beckman LS-9800型液体闪烁计数仪进行检测,采用每分钟放射性脉冲数(cpm)进行统计,实验独立重复检测3次,取平均值。

2 结果

2.1 eIF5A-1基因在宫颈癌和癌旁组织中的表达 免疫印迹结果显示,eIF5A-1蛋白在宫颈癌组织中的表达显著高于其对应的癌旁组织(P<0.01)。其中老年组eIF5A-1蛋白在宫颈癌组织中的表达高于非老年组(P<0.05)。见表1。

表1eIF5A-1蛋白在宫颈组织中的表达

注：与癌旁正常组织比较,**P<0.01;与非老年组比较,△P<0.05.

2.2 宫颈癌SiHa细胞活性检测 MTT结果表明,eIF5A-1 vector组与Empty vector组比较,SiHa细胞的活性显著升高(P<0.01);eIF5A-1 siRNA组与Negative siRNA组进行比较,宫颈癌细胞活性显著下降(P<0.05)。见图1。

2.3 宫颈癌SiHa细胞增殖的检测3H-TdR数据结果显示,转染eIF5A-1 vector组与Empty vector组比较,增殖细胞数量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01);转染eIF5A-1 siRNA质粒组与Negative siRNA组进行比较,增殖宫颈癌细胞数量显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

3 讨论

高危型HPV 16持续性感染是宫颈上皮鳞状细胞永生化的重要致病因素,持续性感染导致E6癌基因的表达对于宫颈癌细胞发生发展尤为重要[3]。文献报道显示,HPV 16 E6基因是通过诱发肿瘤抑制蛋白p53的降解,从而引发宫颈癌的发生[4]。截至目前, HPV 16 E6引发宫颈癌发生的机制众多,本研究为了探寻HPV 16 E6的下游作用靶标,首先分析了宫颈癌组织及癌旁正常组织中eIF5A-1基因的表达,旨在探索HPV 16 E6基因发生过程中,与eIF5A-1基因的潜在关系。免疫印迹结果显示,eIF5A-1蛋白的表达在宫颈癌组织中显著高于其对应的癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.01)。其中老年组eIF5A-1蛋白在宫颈癌组织中的表达高于非老年组。因此,本研究推断在宫颈癌细胞肿瘤转化和永生化过程中,eIF5A-1基因是诱发宫颈癌细胞发生发展的重要下游因子。

注：与Plain medium组比较, *P<0.05; 与Negative siRNA组比较,▲P<0.05; 与Empty vector组比较,△P<0.01图1SiHa细胞的活性检测

注：与Plain medium组比较, *P<0.05,**P<0.01; 与Negative siRNA组比较,▲P<0.05; 与Empty vector组比较,△△P<0.01图2SiHa细胞的增殖检测

在癌症发生发展中,翻译作为基因表达途径中的关键步骤常常处于失调状态[5]。在生物体蛋白质合成中,eIF5A基因发挥重要作用。癌症发生过程中与eIF5A的过表达紧密相关。目前发现有eIF5A-1和eIF5A-2两种异构体,eIF5A-1主要存在于正常组织中,eIF5A-2局限于脑和睾丸[6]。文献报道显示,两种eIF5A水平增多是肿瘤衍生细胞系以及多种癌症的特征,尤其eIF5A-1基因与细胞侵袭性，癌症进展、转移、增殖以及不良的临床预后有关。本研究中,我们着重关注eIF5A-1另一个生物学特性:即其作为调节因子,在哺乳动物细胞凋亡中的潜在作用。文献报道,eIF5A-1的过表达可诱发骨骼干细胞分化[7]和肝癌细胞增殖[8]。本研究结果显示,eIF5A-1在老年人宫颈癌中的表达显著高于非老年人,提示高表达的eIF5A-1基因可能赋予了免疫功能衰退的老年人宫颈癌更强的活力和侵袭能力。采用siRNA有效沉默eIF5A-1基因的表达,宫颈癌细胞的生物学特性,如细胞的活性和增殖均呈现显著降低;而过表达eIF5A-1基因,宫颈癌细胞的活性和增殖均呈现显著增高。以上数据提示了eIF5A-1基因在诱发宫颈癌发生中的重要作用,以上问题的阐明为宫颈癌的防治提供了新的线索和潜在的干预靶标。