张明亮，张淼丹，闫新武，孙长江，顾敬敏，崔子寅，韩文瑜

(1.安阳工学院 生物与食品工程学院，河南 安阳 455000； 2.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062；3.河南省动物疫病防控与营养免疫院士工作站，河南 安阳 455000； 4.洛阳职业技术学院，河南 洛阳 471000；5.河南省孟津县动物卫生监督所，河南 孟津 471100)

铜绿假单胞菌是常见的革兰氏阴性杆菌，广泛分布于自然环境中，是医院常见的获得性感染病原菌[1]。它作为一种常见的条件致病菌，能够在宿主免疫力低下时，长期诱导宿主发生感染，例如能引起囊性纤维化病人、烧伤病人、癌症病人、艾滋病病人等的长期慢性感染[2]。同时，铜绿假单胞菌也能感染动物，例如水貂、貉子、狐狸、猫等，是一种能给公共卫生带来很大风险的病原菌[3-4]。

水貂是重要的毛皮动物，在特种经济动物养殖业中占有重要的地位。水貂出血性肺炎是由铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)引起的以患病貂突然死亡、鼻孔及嘴角流血为主要特征的水貂烈性传染病[5]。水貂出血性肺炎给全球的水貂养殖业带来了巨大的经济损失，研究者于1953年首次确认该病的病原是铜绿假单胞菌[6]。水貂出血性肺炎的暴发具有季节性，于每年的9月至11月呈暴发式流行，造成的死亡率可以达到50%[7]。长期以来，抗生素是人类对抗细菌性感染的有力武器，β-内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗生素是临床中防控铜绿假单胞菌的主要抗生素。但随着临床抗生素的滥用，铜绿假单胞菌耐药率呈现出日渐升高的趋势。本研究从水貂出血性肺炎病料中分离鉴定出20株铜绿假单胞菌，并对其耐药性及生物学特性进行分析，以期为水貂出血性肺炎临床治疗及相关生物制品的研发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株、质粒及试剂 20株疑似貂源铜绿假单胞菌、大肠杆菌克隆菌株DH5α均由吉林大学微生物与免疫学实验室保存；铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853购自中国兽药监察所；PremixTaq，DL2000 DNA Marker、pMD18-T克隆载体购自TaKaRa公司；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司，所有供试培养基根据需要加入质量浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素(Amp)。

1.1.2 供试动物 6周龄体质量为(20±2)g的雌性清洁级昆明小鼠购自吉林大学实验动物中心。

1.1.3 引物的合成 参照GenBank公布的16S rRNA基因序列(GenBank：KT031989.1)合成引物LJ1/LJ2；参照GenBank公布的PAToxA基因序列(GenBank：JX026663.1)合成引物LD1/LD2。所需引物均由北京华大基因研究中心合成(表1)。

表1 PCR扩增引物序列Tab.1 The primer sequences for PCR amplification

1.2 试验方法

1.2.1 铜绿假单胞菌的模板DNA制备 取保存的铜绿假单胞菌菌种划线接种溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，37 ℃培养24 h，观察并挑取优势菌落进行传代，进一步培养纯化。利用煮沸法提取铜绿假单胞菌的基因组DNA：取过夜培养的铜绿假单胞菌菌液200 μL，12 000 r/min离心2 min，弃上清，加100 μL ddH2O，以相同的转速离心后弃上清，再加80 μL ddH2O，沸水煮10 min，离心取上清，置于-20 ℃备用。

1.2.2 铜绿假单胞菌分离株的生化鉴定 参照国标《实验动物 绿脓杆菌检测方法》(GB/T 14926.17—2001)对所分离的疑似铜绿假单胞菌菌株进行生化鉴定[8]。

1.2.3 铜绿假单胞菌分离株的PCR鉴定 16S rRNA基因序列扩增体系20 μL：PremixTaq10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O补平至20 μL。PCR反应程序：预变性94 ℃ 4 min;94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，29个循环；终末延伸72 ℃ 10 min。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。将扩增片段克隆至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行测序鉴定。

1.2.4 铜绿假单胞菌分离株的血清型鉴定 采用玻片凝集法对所分离的铜绿假单胞菌株进行血清型分型。

1.2.5 铜绿假单胞菌分离株的耐药性分析 选用氨基糖苷类、多黏菌素类、β-内酰胺类、氯霉素类、喹诺酮类和四环素类共6类抗生素中的阿米卡星(AMI)、庆大霉素(GEN)、妥布霉素(TOB)、多黏菌素B(PB)、氨苄西林(AMP)、氨曲南(AZT)、头孢呋辛(CEFU)、头孢哌酮(CEFO)、头孢吡肟(CEF)、头孢曲松(CRO)、头孢噻吩(CEP)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(FOR)、头孢西丁(MEF)、头孢唑林(CFZ)、哌拉西林(PIP)、氯霉素(CHL)、洛美沙星(LOM)、环丙沙星(CIP)、四环素(TET)共20种药敏纸片，对所分离的铜绿假单胞菌进行耐药性检测。采用K-B扩散法进行药敏试验，参照美国《抗菌药物敏感性试验执行标准》的判定标准进行药敏结果判断[9]。

1.2.6 铜绿假单胞菌分离株的产毒素A基因及产色素鉴定 无菌挑取所分离的20株铜绿假单胞菌的单菌落，接种于液体LB培养中，37 ℃培养12 h，参照1.2.1中的方法提取各分离株的基因组DNA。采用引物LD1/LD2鉴定所分离的铜绿假单胞菌株是否产生毒素A(ToxA)基因。反应程序：预变性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30个循环；终末延伸72 ℃ 10 min。PCR反应结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果并拍照。将20株铜绿假单胞菌转接于液体LB培养中，37 ℃培养12 h，观察铜绿假单胞菌的产色素情况。

1.2.7 铜绿假单胞菌分离株的强毒株筛选 将42只20 g左右的昆明小鼠随机分为21组并编号。将20株铜绿假单胞菌转接于液体LB培养中，37 ℃培养12 h，分别调整菌液浓度为1×107cfu/mL，将调整好的菌液注射0.1 mL(含1×106cfu的铜绿假单胞菌)于小鼠腹腔，观察7 d。

1.2.8 铜绿假单胞菌分离株ZHDL9感染小鼠后的毒力检测 将铜绿假单胞菌分离株ZHDL9转接于液体LB培养中，37 ℃培养12 h，调整菌液浓度为5×1010cfu/mL。然后利用无菌PBS分别将其倍比稀释成5×1010、5×109、5×108、5×107cfu/mL共4个浓度梯度。每个浓度梯度鼻腔接种10只小鼠(注射量为0.1 mL/只)，观察30 d，记录每组小鼠死亡情况。

2 结果与分析

2.1 铜绿假单胞菌分离菌株的生化特征

如表2所示，所分离出的20株疑似铜绿假单胞菌的病原菌均能在十六烷三甲基溴化铵培养基、乙酰胺培养基、普通琼脂斜面培养基42 ℃生长；并同时能在硝酸盐蛋白胨水培养基上产气，能使明胶液化，氧化酶试验呈阳性。

表2 铜绿假单胞菌分离株的生化鉴定Tab.2 Biochemical identification of suspected PA isolates

2.2 铜绿假单胞菌分离株16S rRNA扩增结果

如图1所示，对20株铜绿假单胞菌分离株的16S rRNA扩增结果表明，所分离的20株病原菌均为铜绿假单胞菌。

M：DL2000 DNA Marker；2、19：水对照；1、3—18、20—22：铜绿假单胞菌分离株16S rRNAM：DL2000 DNA Marker; 2,19:Water control; 1,3—18,20—22:PA isolates 16S rRNA

2.3 铜绿假单胞菌分离株的血清型分析

如表3所示，20株铜绿假单胞菌分离株表现出G型和B型2种血清型，其比例分别为85%和15%，因此，铜绿假单胞菌分离株的血清型以G型为主。

表3 铜绿假单胞菌的血清型Tab.3 Classification of serotype of PA isolates

2.4 铜绿假单胞菌分离株的耐药性分析

如表4所示，20株分离的铜绿假单胞菌对氨基糖苷类的3种抗生素的耐药率为5%～50%，对妥布霉素的敏感率最高，为95%；对多黏菌素B的耐药率为15%；对β-内酰胺类的耐药率高达30%～100%，其中对氨苄西林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢西丁、头孢唑林均不敏感；对环丙沙星和洛美沙星的耐药率分别为55%和65%；对氯霉素的耐药率达到了95%，对四环素100%耐药。

表4 铜绿假单胞菌分离株对20种抗生素的敏感性试验Tab.4 Antimicrobial susceptibility test of PA isolates against 20 antimicrobial drugs

注: R表示不敏感，I表示中度敏感，S表示敏感。

Note: R indicates insensitivity, I indicates moderate sensitivity, S indicates sensitivity.

如表5所示，对不同血清型(血清型B型3株，G型17株)铜绿假单胞菌株进行20种抗生素的耐药率分析发现，血清型B型菌株的耐药率为0～100%，而血清型G型的耐药率则为5.88%～100%。血清型G型和B型对β-内酰胺类抗生素头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻吩、头孢噻肟、头胞西丁、头孢唑林的耐药率均为100%，这可能与临床大量应用该类抗生素有关。

与此同时，对20株铜绿假单胞菌的多重耐药性进行分析发现，所有分离株多重耐药性在10耐至18耐之间，表明铜绿假单胞菌分离株对常见20种抗生素耐药严重(表6)，在临床治疗和预防中要遵循联合用药的原则，避免更多耐药菌株的出现。

表5 不同血清型铜绿假单胞菌分离株对20种抗生素的耐药率Tab.5 Resistance rates of PA isolates from different serotyping against 20 antimicrobial drugs %

表6 铜绿假单胞菌分离株的多重耐药分析Tab.6 Multiple drug resistance analysis of PA isolates from different serotyping against 20 antimicrobial drugs %

2.5 铜绿假单胞菌分离株的ToxA基因及产色素分析

如图2所示，对20株铜绿假单胞菌分离株的ToxA基因检测表明，所有分离株均检测出397 bp的ToxA基因片段。因此，铜绿假单胞菌分离株都能产生毒素A。

20株铜绿假单胞菌分离株中有2株能够产浅蓝色的色素，其他18株能够产黄绿色色素(图3)，说明铜绿假单胞菌分离株以产黄绿色色素为主。

M：DL2000 DNA Marker；5、14：水对照；1—4、6—13、15—22：铜绿假单胞菌分离株的ToxA基因片段M:DL2000 DNA Marker; 5,14:Water control; 1—4,6—13,15—22:ToxAgene fragment in PA isolates

图3 铜绿假单胞菌的产色素鉴定

2.6 铜绿假单胞菌分离株的强毒株筛选

小鼠在进行铜绿假单胞菌腹腔接种后，均表现出精神沉郁、不食、被毛蓬松的症状。部分菌株的攻毒小鼠在攻毒16 h后陆续出现死亡，144 h后没有小鼠死亡。其中，接种铜绿假单胞菌分离株ZHDL6和ZHDL9的小鼠在24 h全部死亡，而接种分离株ZHDL9后16 h即有1只小鼠死亡，因此，筛选的铜绿假单胞菌分离株ZHDL9为强毒株(表7)。

表7 铜绿假单胞菌分离株的强毒株筛选Tab.7 Screening of virulent strain in PA isolates

2.7 铜绿假单胞分离株ZHDL9感染后小鼠毒力的分析

接种铜绿假单胞菌分离株ZHDL9后，小鼠均表现出精神沉郁、不食、被毛蓬松、咳嗽等症状。4个剂量组中只有最低剂量5×106cfu组的小鼠有存活(表8)。如图4所示，对死亡小鼠进行剖检，可观察到被感染的小鼠具有严重的肺部充血，病理切片显示，死亡小鼠的肺泡腔缩小，肺泡壁增厚。根据动物死亡数量，得出5×107cfu剂量的铜绿假单胞菌分离株ZHDL9能够使试验组小鼠完全致死(表8)。为进一步得出铜绿假单胞菌分离株ZHDL9的绝对致死量(LD100)，将稀释度分别为5×107、4×107、3×107、2×107、1×107cfu的分离株ZHDL9分别鼻腔接种小鼠，结果发现，只有最高剂量5×107cfu组的小鼠全部死亡。因此，分离株ZHDL9的小鼠绝对致死量(LD100)为5×107cfu。

对死亡小鼠的肺部进行分菌培养后，利用铜绿假单胞菌的16S rRNA通用引物进行扩增，能得到铜绿假单胞菌16S rRNA基因序列条带，将其回收后克隆至pMD18-T载体后进行测序，结果表明，由死亡小鼠肺部所分离得到菌株是铜绿假单胞菌，证明小鼠是由铜绿假单胞菌感染而死亡(图5)。

表8 铜绿假单胞菌分离株的毒力检测Tab.8 Virulence detection of PA isolates

a：接种铜绿假单胞菌分离株ZHDL9后死亡小鼠；b：接种铜绿假单胞菌株ZHDL9后死亡小鼠肺脏；c：死亡小鼠肺脏病理切片(10×100)；d：对照小鼠解剖；e：对照小鼠肺脏；f：对照小鼠肺脏切片(10×100)

M：DL2000 DNA Marker； 1：水对照；2—4：铜绿假单胞菌16S rRNA M:DL2000 DNA Marker; 1:Water control;2—4:PA 16S rRNA

3 结论与讨论

铜绿假单胞菌常感染免疫系统降低的人群，从而引起发病人群的获得性肺炎[10-12]，还能感染狗、猫、水貂、狐狸等动物[13]。铜绿假单胞菌在水貂饲养环境中分布广泛，在水、饲槽、饮水槽等处均可分离到。而水貂是对铜绿假单胞菌敏感的动物[14-15]，感染后会患出血性肺炎，患病水貂往往发生突然死亡，并伴随有口鼻出血及肺部严重出血[6]。

目前，在医院的临床治疗中，β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素及喹诺酮类抗生素是治疗铜绿假单胞菌的常用抗生素。但是，近些年铜绿假单胞菌对这3类抗生素的耐药率逐渐升高[16]。有研究报道，在所分离的铜绿假单胞菌中发现了耐药基因blaNDM-1[17]，从而进一步说明该病原菌的耐药现象越来越严重，抗生素对该病的防控形势日渐严峻。本研究对分离于临床貂场的20株铜绿假单胞菌进行耐药性试验，结果表明，所分离的水貂场中铜绿假单胞菌的耐药非常严重，单一分离株最高对18种抗生素耐药，对临床常见的β-内酰胺类抗生素氨苄西林、头孢呋辛、头孢西丁、头孢曲松、头孢唑林、头孢噻吩及头孢噻肟的耐药率达到了100%。铜绿假单胞菌较高的耐药率给临床水貂出血性肺炎的防控带来了极大的困难。2012年的5—6月，辽宁大连及山东的一些貂场暴发了水貂出血性肺炎，水貂死亡率接近50%。这可能与高耐药性的铜绿假单胞菌密切相关，即常规的抗生素治疗无效果或者效果不明显，而貂场该病原菌高耐药菌株的出现可能与不合理用药密切相关。本研究发现，20株铜绿假单胞菌分离株对妥布霉素的敏感率为95%，提示妥布霉素可能在临床防控水貂出血性肺炎中效果明显。

疫苗被认为是防控感染性疾病的有效手段。铜绿假单胞菌具有众多的血清型，这也是目前该病原菌相关疫苗迟迟未上市的主要原因。有关资料显示，感染水貂的铜绿假单胞菌血清型常见的有G型、B型、I型和M型[7]。本研究中，20株铜绿假单胞菌分离株中有17株为G型，这与目前报道的诸多文献相一致[18-19]，表明G型的铜绿假单胞菌是水貂出血性肺炎的感染过程中的主要血清型，其具体致病机制有待于进一步研究。

与此同时，对20株铜绿假单胞菌分离株的毒力进行研究发现，大部分铜绿假单胞菌分离株接种小鼠72 h后，小鼠仅有零星死亡，其他小鼠表现出精神萎靡等临床症状，而接种了分离株ZHDL6和ZHDL9的小鼠，在24 h时全部死亡，剖检后的小鼠肺脏出现严重的出血现象，说明不同的铜绿假单胞菌分离株存在较大的毒力差异，且小鼠可作为铜绿假单胞菌感染肺部的模式动物。此外，接种铜绿假单胞菌分离株ZHDL9的小鼠在16 h即发生了死亡，说明分离株ZHDL9的毒力较其他分离株强，为疫苗候选菌株的筛选提供了依据，有助于将来疫苗的开发。

毒力因子是铜绿假单胞菌行使其毒力的前提。常见的毒力因子有毒素A、脂多糖(LPS)、溶血素、毒素S等。毒素A是铜绿假单胞菌的胞外分泌毒素，具有严格的种属特异性，分泌该毒素的铜绿假单胞菌的分离率通常在90%左右。毒素A的含量常常决定了铜绿假单胞菌感染宿主后对宿主的损伤程度。一方面毒素A能够抑制蛋白质因子EF-2的活性，从而抑制相关蛋白质的合成来发挥其毒力作用，另一方面毒素A还能形成一些免疫复合物来进一步加强其毒力作用[20]。本研究中，铜绿假单胞菌分离株均能分泌毒素A，并且在临床分离病原的过程中，发现死亡水貂的肺部有弥漫性出血的现象，也说明了毒素A可能介导水貂的肺部损伤。因此，对毒素A进行深入研究，可能能够进一步解释水貂为什么是目前唯一对铜绿假单胞菌敏感的动物[21]。

总之，本研究发现水貂出血性肺炎病原(铜绿假单胞菌)新近流行株对妥布霉素较为敏感，可为该病的临床治疗提供理论依据。同时本研究筛选出毒力较强的铜绿假单胞菌分离株ZHDL9，为貂源铜绿假单胞菌生物制品的研发提供了依据。