赵晓冬 王红芳 胥保华

（山东农业大学动物科技学院，泰安 271018）

铜是动物机体内必需的微量元素，其影响机体的代谢和生长发育、免疫功能，其不仅通过构成机体内的含铜酶（如超氧化物歧化酶、铜蓝蛋白等）参与机体代谢过程，而且参与机体造血、自由基防御等活动[1]。蜂蜜是蜜蜂在自然状态下主要的能量食物，含有多种矿物质。蜂蜜中常见的微量元素包括K、Na、Mg、Zn、Fe 和Cu 等20 多种，常量元素约占所有矿物质的98%～99%[2]。Bounias 等研究了有机铜源葡萄糖酸铜和乳酸铜对蜜蜂蜂螨防治的效果，发现葡萄糖酸铜效果更佳[3]。

铜参与机体的抗氧化功能主要是通过影响含铜氧化酶的活性而发挥作用的。铜是铜锌超氧化物歧化酶的重要组成部分，可以催化机体代谢的有毒物质转化为氧自由基和H2O2。蜜蜂中肠位于前胃之后，是消化和吸收的器官。中肠肠腔内有多层的围食膜，可保护中肠细胞减少磨损，使中肠消化酶穿过围食膜消化食物，再由中肠细胞吸收分解的营养物。在分子水平，低浓度的Cu2+可以食物中铜对昆虫生长发育有重要作用，铜水平对棕尾别麻蝇的影响得出：饲料中添加低浓度的铜能够提高棕尾别麻蝇的生理功能，而高浓度的铜则会产生抑制作用[4]。在蜜蜂人工饲料中添加铜的有机盐——葡萄糖酸铜可以提高蜂群的抗病能力，但是铜的适宜添加水平及其对蜜蜂生理机能的影响还有待进一步研究证明。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物为意大利蜜蜂，取自蜂群健康、群势基本相同的蜂群。试验用葡萄糖酸铜（山东西亚化学有限公司），货号为L103479-25g，纯度为98%。

1.2 意大利蜜蜂工蜂幼虫饲粮配制

试验采用6 种不同铜水平的人工幼虫饲粮饲喂意大利蜜蜂工蜂，6 种饲粮分别标记为A、B、C、D、E、F，饲粮组成见表1。

1.3 饲养管理

试验于2017年在山东农业大学动物科技学院完成，供试蜂场为山东农业大学南校区试验蜂场，蜜蜂在30℃和50%±5%R.H.的恒温恒湿培养箱内进行饲养。在饲养过程中保证培养箱和饲喂盒的卫生，防止其他不利因素对蜜蜂产生的影响，饲养至蜜蜂全部死亡。分别于9日龄测定体成分、血淋巴生化指标、抗氧化指标、相关基因的相对表达量、制作中肠切片，并测定寿命。

1.4 测定指标及相关方法

1.4.1 离群意大利蜜蜂寿命的测定

在23cm×9.5cm×5cm 蜂盒中饲养，并置于培养箱中，调节恒温恒湿培养箱的温度为30℃，湿度为50%±5%，每天定时记录死亡的蜜蜂数，直至蜜蜂全部死亡。

1.4.2 离群意大利蜜蜂工蜂中肠切片的制作

选用组织石蜡包埋切片。

1.4.3 离群意大利蜜蜂蜂体铜含量的测定

从每试验组取9日龄的蜜蜂30 只，每10 只蜜蜂为一个重复。采用硝酸-双氧水消解，ICP-ms 测定铜含量。

表1 饲养离群意大利蜜蜂饲粮组成及铜水平

表2 试验中PCR引物

1.4.4 血淋巴生化指标的测定

采用体积为20μl 的毛细管吸取9日龄蜜蜂血淋巴50μl 于加有苯基硫脲的1.5ml 离心管中，于-80℃进行保存。测定时，4℃条件下3000r/min离心10min，取上清备用，采用日立7020 型全自动生化分析仪测定蜂体血淋巴中总蛋白（TP）、总胆固醇（TCHO）。

1.4.5 蜜蜂中抗氧化酶活性的测定

从各试验组9日龄蜜蜂分别取出12 只蜜蜂，每3 只蜜蜂为一个重复，使用SOD 试剂盒A007（南京建成生物工程研究所）测定SOD 活性。利用可见光分光光度计（UV-2000）测定吸光度并计算蜂体抗氧化能力。

1.4.6 工蜂幼虫虫体溶菌酶、防卫素1 基因相对表达量的测定

采用Trizol 法提取总RNA，使用反转录试剂盒(TaKaRa)将提取的总RNA 样品反转录为cDNA，-20℃保存备用。目的基因引物设计参考序列来自于NCBI 数据库，采用Primer 5.0 进行引物设计，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，委托生工生物科技有限公司合成引物，引物序列如表2所示。

1.5 数据处理与分析

采用SAS 9.2 软件对数据进行单因素方差分析和Duncan 氏法多重比较，P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 铜对蜜蜂寿命的影响

从蜜蜂存活率曲线图来看，整个饲养期间，对照组A、处理组B、C 存活率明显高于处理组D、E、F，10 天内，各处理组的存活率差异很小，自11 天起，处理组B 存活率明显高于其他组（见图1）。

2.2 铜对蜜蜂中肠围食膜的影响

图1 铜对蜜蜂存活率的影响

图2-1 A组蜜蜂中肠组织切片，H＆E染色，100×

图2-2 B组蜜蜂中肠组织切片，H＆E染色，100×

图2-3 C组蜜蜂中肠组织切片，H＆E染色，100×

图2-4 D组蜜蜂中肠组织切片，H＆E染色，100×

图2-5 E组蜜蜂中肠组织切片，H＆E染色，100×

图2-6 F组蜜蜂中肠组织切片，H＆E染色，100×

图3 离群蜜蜂体组织铜含量

图4 饲粮中铜水平对9日龄蜜蜂血淋巴生化性能的影响

9日龄中肠切片显示（100×）（见图2），饲粮中铜的不同添加水平影响离群蜜蜂中肠围食膜的结构。对照组A、处理组B、C 蜜蜂中肠的PM 较厚且形态匀称，而B 处理组PM 最厚；D、E、F 处理组蜜蜂中肠PM 的厚度不一。当饲粮中铜水平为2.00μg/g 时对蜜蜂中肠围食膜的结构相对来说较为完整。

表3 铜对离群蜜蜂Cu/Zn-SOD活性的影响

表4 铜对蜜蜂CAT相对表达量的影响

2.3 铜对蜜蜂体组织铜含量的影响

由图3可知，3、6、9日龄体组织Cu 含量也随饲粮中Cu 水平不断增加而显著上升（P＜0.05），对照组蜜蜂体组织Cu 含量显著小于其他组（P＜0.05）。

2.4 铜对蜜蜂血淋巴生化指标的影响

由图4可知，饲粮中铜的添加可显著影响蜜蜂体中总蛋白、总胆固醇含量（P＜0.05)，随着饲粮中铜添加水平的升高，9日龄蜜蜂体中总蛋白、总胆固醇含量均下降（P＜0.05)。

2.5 铜对蜜蜂抗氧化能力及相关基因相对表达量的影响

2.5.1 铜对蜜蜂抗氧化能力的影响

由表3可知，D 处理组3日龄蜜蜂Cu/Zn-SOD活性显著高于其他组（P＜0.05），B 处理组6日龄蜜蜂Cu/Zn-SOD 活性显著高于对照组A 组以及其他处理组（P＜0.05），3、6日龄蜜蜂Cu/Zn-SOD 活性都呈现先升高后下降的趋势。

2.5.2 铜对蜜蜂抗氧化相关基因相对表达量的影响

由表4可知，铜显著影响9日龄蜜蜂CAT基因表达量（P＜0.05）。随着幼虫饲粮中铜水平的不断升高，9日龄蜜蜂幼虫CAT基因相对表达量呈现逐渐增加的趋势。

2.5.3 铜对蜜蜂高亲和力铜吸收蛋白基因相对表达量的影响

由图5可知，9日龄幼虫F 处理组Ctr1基因的相对表达量显著高于其他组（P＜0.01），随着幼虫饲粮中铜水平的不断增加，9日龄蜜蜂Cu/Zn-SOD基因相对表达量呈现逐渐增加的趋势（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 饲粮中铜的添加水平影响蜜蜂生长发育

图5 铜对9日龄蜜蜂Ctr1相对表达量的影响

Adam 等[4]研究表明，Cu2+主要沉积在双翅目幼虫中肠上皮细胞的细胞浆内。过量的Cu2+使中肠上皮细胞发生变性、肿胀、破裂[5]。本实验中，在饲粮中添加铜能够保护肠道，有助于肠道的生长发育，当蜜蜂饲粮糖浆中铜添加量在2.00μg/g 时能够使中肠围食膜的结构较为均匀完整，有利于提高蜜蜂的健康水平。昆虫取食含Cu2+的饲料后，Cu2+在体内的积累量与饲料中Cu2+浓度存在显著的剂量效应关系，并随着取食时间的延长而增加[6]。在昆虫体内存在毒物兴奋效应，即低浓度刺激、高浓度抑制的剂量反应现象[7]。本研究中高剂量的Cu2+胁迫会显著降低昆虫的总蛋白和总脂浓度。

3.2 饲粮中铜的添加水平影响蜜蜂的抗氧化能力

在昆虫体内存在抗氧化酶系统，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）等[8]。重金属铜可与酶分子中的其他金属离子发生竞争性替代作用而抑制酶活力，使昆虫体内生化反应缓慢，并减弱昆虫清除氧自由基能力，最终抑制昆虫代谢和生长发育，延长其发育历期。综合本试验结果表明，饲粮中铜的添加水平为2.00～4.00μg/g时，意大利蜜蜂工蜂的抗氧化状态最好。

3.3 饲粮中铜的添加水平影响铜离子转运蛋白基因相对表达量

铜离子转运蛋白家族主要包括铜离子转运蛋白（Ctr）和铜离子转运磷酸化ATP 酶（Cu-ATPase）。Ctr1的表达水平与细胞内铜离子浓度有密切关系，其表达量的多少直接对机体铜代谢产生影响，铜缺乏时可促进该蛋白的表达，过量则抑制其表达。本研究表明铜的添加对于蜂体Ctr1的表达有显著影响，其相对表达量在铜的添加水平0.00～10.00μg/g 的范围内有升高的趋势，然而目前关于饲粮中铜水平对于其代谢相关酶的影响尚未见报道。

4 结论

（1）当饲粮中铜的添加水平为2.00μg/g 时能显著提高意大利蜜蜂工蜂的寿命，且对蜜蜂中肠食膜的结构最为有利。

（2）当饲粮中铜的添加水平在0.00～10.00μg/g 的范围内不断升高时，9日龄蜜蜂体组织铜含量显著升高，铜对9日龄意大利蜜蜂过氧化氢酶基因相对表达量、高亲和力铜转运蛋白基因相对表达量显著增加，但蜜蜂血淋巴中总蛋白和总胆固醇含量显著降低。

（3） 6日龄和9日龄蜜蜂蜂体超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）活性随着铜的添加水平的提高出现先升高后降低的趋势，都在2.00μg/g 时活性最高。

（4） 综合考虑以上指标，推荐意大利蜜蜂工蜂饲粮的适宜铜的添加水平为2.00～4.00μg/g。