刘向东 苏 松 罗 德 陈鑫培 周鹏程 李 波

肝移植是目前治疗终末期肝病和急性肝衰竭的唯一有效的方法，现已在世界范围内广泛开展。然而，原发性移植肝无功能和功能延迟仍然是限制肝移植的应用及其成功率的主要原因。近年来，国内外研究证实这些并发症的发生可能与供肝在冷保存过程中所遭受的冷缺血损伤有着密切的关系[1,2]。冷缺血通过激活肝窦上皮细胞和Kupffer细胞释放白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性细胞因子，被认为是降低移植肝功能的重要因素[3,4]。因此，进一步研究肝脏冷缺血损伤机制并探索有效的拮抗手段已成为目前肝移植界重要的研究方向之一。甘草素(glycyrrhizin，GL)是从甘草类植物光果甘草的根中提取的一种三萜类化合物，具有抗炎作用，已经被广泛用于乙型和丙型肝炎病毒引起的慢性肝炎患者[5]。最近的一项研究表明，GL可以通过抑制HMGB1的表达，从而降低肝脏热I/R损伤[6]。然而，GL对于肝脏冷缺血损伤的作用及其机制尚不清楚。本研究旨在通过模拟肝移植供肝冷保存过程，探讨在大鼠模型中GL对肝脏冷缺血损伤的作用及其潜在机制。

材料与方法

1.实验动物与主要试剂：选取健康成年雄性Wistar大鼠，体质量250～350g，由西南医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(111)2018-065，按实验要求随机方法分笼饲养，实验前1天禁食，可自由饮水。Krebs-Henseleit(KH)缓冲液的配制：20mmol/L N-2-羟乙基哌嗪-N02-乙磺酸(HEPES，pH值为7.4)，115mmol/L NaCl，25mmol/L碳酸氢钠(NaHCO3)，5.9mmol/L氯化钾(KCl)，1.2mmol/L氯化镁(MgCl2)，1.2mmol/L磷酸二氢钠(NaH2PO4)，1.2mmol/L硫酸钠(Na2SO4)，2.5mmol/L氯化钙(CaCl2)。实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)试剂盒购于美国Invitrogen公司，兔抗HMGB1的多克隆抗体购于英国Abcam公司，兔抗TLR4的多克隆抗体和兔抗NF-κB p65多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司，ELISA试剂盒购于美国Biosource公司，TUNEL试剂盒购于美国Oncor公司。

2.肝脏手术与保存：采用氯胺酮(70mg/kg)和甲苯噻嗪(30mg/kg)腹腔注射麻醉。行腹部正中切口，暴露肝脏。胆总管、门静脉和肝上下腔静脉使用聚乙烯导管插管。然后于室温下使用经滤过和氧化(95%O2/5%CO2)的KH缓冲液原位灌注肝脏，速度约为20ml/min。再用75ml冷(4℃)组氨酸-色氨酸-酮戊二酸(histidine-tryptophan-ketoglutarate，HTK)溶液冲洗后，取出肝脏，最后于冷保存液中保存24h。保存液为不含GL的HTK溶液(HTK组，n=30)和50、100、150g/L的GL，分别为低剂量(LGL，n=30)，中剂量(MGL，n=30)和高剂量(HGL，n=30)组。对照组(sham，n=30)的肝脏取出后立即行再灌注。

3.肝脏灌注：冷保存后的肝脏，使用5ml冷KH缓冲液经门静脉灌注，收集灌流液以测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和炎性细胞因子(TNF-α和IL-6)水平。然后将肝脏连接到灌注装置，使用KH缓冲液在37℃(pH值为7.4)下进行灌注，流速为20ml/min，时间为60min。胆汁使用称重过的烧杯收集。

4.苏木精-伊红染色：在冷藏与KH缓冲液灌注后，切除肝左叶，使用甲醛溶液固定，石蜡包埋和切片(3mm)。苏木精-伊红染色后，于光镜下观察。采用Wu等[7]建立的肝损伤评分标准：0分，无明显病理改变；1分，<10%；2分，11%～50%；3分，>50%肝细胞肿胀和胞质空泡化。切片以双盲的方式由2名观察者进行分析，每个切片中选择5个视野，计算平均得分。

5.LDH与胆汁水平测定：通过分光光度法分析灌流液中LDH水平以评估肝细胞损伤程度。通过测量60min再灌注期间胆管总插管的胆汁分泌来评价肝功能情况。

6.实时荧光定量PCR：利用Trizol法从肝脏组织中提取细胞总RNA，使用Prime Script RT试剂盒反转录成cDNA。使用HMGB1基因特异性TaqMan探针，TaqMan Fast Universal 预混液，StepOne Plus实时PCR操作系统进行实时荧光定量PCR。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)的引物序列为5′-TAAAAAGCCGAGAGGCAAAA-3′，5′-GCAGACATGGTCTTCCACGT-3′。结果用Ct值分析，以β-肌动蛋白基因作为内参，计算相对表达水平。

7.免疫组化：用免疫组织化学染色法分析HMGB1、Toll样受体4(TLR4)和核因子(NF)-κB的表达。首先，石蜡切片用二甲苯脱蜡，乙醇水化，并在1%的过氧化氢溶液中孵育10min。然后用兔抗HMGB1的多克隆抗体(1∶250)、兔抗TLR4的多克隆抗体(1∶200)和兔抗NF-κB p65多克隆抗体(1∶200)在室温下孵育30min。其次使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤，加入生物素化山羊抗兔第二抗体孵育30min。最后使用AB酶试剂孵育30min，加入过氧化物酶底物，苏木精复染10s。显微镜下观察切片，在每个切片中随机选择5个视野，测量每个视野中阳性细胞的百分比，计算每个切片的平均百分比。

8.酶联免疫吸附实验：使用特定的大鼠ELISA试剂盒测量灌流液中的炎性介质(TNF-α、IL-6)水平。

9.肝细胞凋亡检测：使用TUNEL试剂盒检测肝细胞凋亡，每张切片随机选择6个视野计算凋亡细胞比例。

结 果

1.GL降低冷保存后肝脏LDH释放：肝细胞LDH的释放是肝脏损伤的重要指标。在HTK溶液中冷保存24h后，灌流液中LDH水平与对照组比较显著增加(2549.7±681.8U/L vs 65.3±9.5U/L，P=0.000)。与未加GL的HTK溶液比较，加入GL的HTK溶液显著抑制了LDH的释放(LGL：1573.7±298.6U/L；MGL：1290.6±188.9U/L；HGL：627.8±192.3U/L，P均=0.000)。GL的抑制活性呈浓度依赖性(HGL vs LGL，HGL vs MGL，P均=0.000，图1)。

图1 冷保存24h释放的LDH水平与Sham组比较，*P<0.01；与HTK组比较，#P<0.01；与HGL组比较，ΔP<0.01

2.GL改善再灌注后胆汁分泌：胆汁分泌水平是再灌注后肝功能恢复程度的重要标志物。与对照组比较，在HTK溶液中冷保存24h后的肝脏胆汁分泌显著减少(32.5±5.5μl/g vs 49.7±3.1μl/g，P<0.01)，提示肝脏功能受损。与未加GL的HTK溶液比较，加入GL的HTK溶液的显著增加了胆汁的分泌(LGL：34.8±6.2μl/g，P<0.05；MGL：42.8±9.3μl/g，P<0.01；HGL：46.3±8.2μl/g，P<0.01,图2)。

图2 灌注60min后胆汁分泌水平与HTK组比较，*P<0.01；与LGL组比较，#P<0.05

3.GL减轻肝组织损伤和减少肝细胞凋亡：肝组织损伤采用组织病理学评分进行评价。对保存24h的肝脏进行组织学评价。如图3所示，对照组的肝脏损伤组织病理学评分最低(0.2±0.1分)，提示肝组织损伤最小。相反，保存在冷HTK溶液中的肝脏则有显著较高的评分(2.6±0.5分)，而与未加GL的HTK溶液比较，GL的加入明显降低了病理组织学评分(LGL：1.5±0.4；MGL：1.3±0.5；HGL：1.0±0.5；P均<0.01)。此外，与HTK组比较，MGL组和HGL组肝细胞凋亡指数显著降低(MGL：13.2%±3.5%；HGL：8.3%±2.1%；HTK：21.1%±6.3%；MGL vs HTK，P<0.05；HGL vs HTK，P<0.01)。与LGL组和MGL组比较，HGL组TUNEL阳性细胞数显著减少(P均<0.01，图4)。

图3 各组肝脏的组织病理学改变(HE，×400)A.对照组；B.HTK组；C.LGL组；D.MGL组；E.HGL组；与对照组比较，*P=0.000；与HTK组比较，#P<0.01；与HGL组比较，ΔP<0.01

图4 各组肝脏的肝细胞凋亡情况(TUNEL,×400)A.HTK组；B.LGL组；C.MGL组；D.HGL组；与HTK组比较，*P<0.05；与HGL组比较，#P<0.01

4.GL下调冷缺血后HMGB1-TLR4的表达：如图5免疫组化染色结果所示，HTK溶液冷保存肝脏相比对照组HMGB1阳性细胞比例显著增加(8.09%±1.73% vs 1.69%±0.42%，P<0.05)。此外，HMGB1在冷保存后的肝脏中从肝细胞的细胞核向细胞质转移。肝细胞TLR4的表达在HTK溶液中贮存后也呈上调趋势(图6)。TLR4阳性细胞在HTK溶液冷保存肝脏中的百分比显著高于对照组(9.1%±1.9% vs 1.8%±0.6%，P<0.01,图7)。相反，与不含GL的HTK溶液冷保存的肝脏比较，LGL、MGL和HGL组HMGB1阳性细胞比例均显著降低(LGL:5.16%±0.93%，MGL:4.44%±0.73%，HGL:2.01%±0.65%，P均<0.01)，且呈浓度依赖性(图5)。TLR4阳性细胞在LGL(5.3%±2.2%)、MGL(4.1%±1.4%)和HGL(2.5%±0.7%)中的比例也显著低于HTK组(9.1%±1.9%，P均<0.01,图7)。

图5 冷缺血后HMGB1 mRNA以及蛋白的表达情况(免疫组化,×400)A.HMGB1 mRNA表达情况；B.HMB1免疫组化染色；a.对照组；b.HTK组；c.LGL组；d.MGL组；e.HGL组；C.HMGB1 蛋白表达情况；与HTK组比较，*P<0.05；与HGL组比较，#P<0.01

图6 NF-κB/p65(A～E)和TLR4(F～J)的表达情况(免疫组化,×400)A、F.对照组；B、G.HTK组；C、H.LGL组；D、I.MGL组；E、J.HGL组

图7 TLR4蛋白的表达指数与HTK组比较，*P<0.01；与HGL组比较，#P<0.05

图8 NF-κB/p65蛋白的表达指数与HTK组比较，*P<0.05；与HGL组比较，#P<0.05

5.GL抑制NF-κB的活化和炎性细胞因子的表达：如图6和图8所示，在HTK溶液中储存的肝脏中NF-κB/p65阳性细胞比例(10.3%±2.6%)显著高于对照组肝脏(2.7%±0.7%,P<0.01)。加入GL的HTK溶液中储存的肝脏NF-κB/p65阳性细胞的比例呈浓度依赖性下降(LGL:6.3%±2.2%,P<0.05；MGL:5.8%±1.7%,P<0.01；HGL:3.6%±1.4%,P<0.01)。酶联免疫吸附试验结果显示，与未加GL的HTK溶液冷保存肝脏比较，加入GL的HTK溶液冷保存肝脏的炎性细胞因子IL-6和TNF-α明显降低，且呈浓度依赖性(P<0.01,图9)。

图9 IL-6和TNF-α的表达情况与对照组比较，*P<0.01；与HTK组比较，#P<0.01；与HGL组比较，ΔP<0.01

讨 论

低温的保护作用已经广泛应用于器官和组织的储存过程中。然而不足的是，在其发挥保护作用的同时，也会引起肝细胞的损伤，极大的限制了移植器官的保存以及边缘供体的使用[7，8]。因此，寻找一种新的方法提高冷保存的效果对于减轻肝脏冷保存损伤、提高肝移植物成活率具有及其重要的意义。

GL是甘草根中的主要活性成分，由甘草酸和葡萄糖醛酸组成，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤和保肝等多种药理作用。在亚洲地区，GL已被广泛用于治疗慢性病毒性肝炎[9，10]。近期研究表明，GL可以通过抑制HMGB1的细胞因子活性对大鼠脑缺血再灌注损伤起保护作用[5]。本研究结果发现，加入GL的HTK溶液能显著降低冷保存后肝脏LDH释放，增加胆汁分泌，减轻肝组织损伤以及减少肝细胞凋亡，上述作用随着GL浓度的变化而变化，这说明GL对于肝脏的冷缺血损伤也具有明显的保护作用，并且其保护作用具有浓度依赖性。

HMGB1是一种非染色体核蛋白，主要由缺血或坏死的细胞释放，并介导炎性反应、细胞死亡和多种器官组织的缺血再灌注损伤[11～13]。Gong等[5]的研究结果显示，GL可作为HMGB1抑制剂，对局灶性脑缺血再灌注诱导的炎性反应、氧化应激和细胞凋亡起保护作用。研究表明，GL对大鼠缺血再灌注后引起的肝脏损伤的预防作用可能与抑制Kupffer细胞产生HMGB1有关[6]。HMGB1通过与多个受体相互作用而发挥作用，包括晚期糖基化终末产物受体和TLR[14]。TLR4是介导炎性反应的重要受体，在缺血性损伤中也起着重要的作用。Zhu等[15]报道，在心脏移植模型中，HMGB1-TLR4-IL-23-IL-1A轴参与了炎性反应因子的分泌，从而导致心脏损伤。

此外，还有研究报道了HMGB1-TLR4信号通路参与了小鼠肠道的缺血再灌注损伤[16]。HMGB1-TLR4信号的转导致使NF-κB的活化和炎性细胞因子的产生。NF-κB是一种与免疫球蛋白基因的κB序列特异结合的蛋白因子，是炎性反应的关键转录调节因子。它通过诱导炎性细胞因子的产生与释放，从而导致细胞死亡和组织损伤。因此，本研究探索了HMGB1-TLR4信号通路与GL对于肝脏冷缺血损伤保护作用中的关系。本研究结果显示，加入GL的HTK溶液能显著下调冷缺血后HMGB1和TLR4的表达，同时也抑制了转录调节因子NF-κB的活化。炎性细胞因子TNF-α与IL-6的表达也随着GL的加入而降低。这些结果表明，GL可能通过抑制HMGB1和TLR4的表达，减少NF-κB的活化和TNF-α、IL-6的释放，从而减轻肝脏的冷缺血损伤。

综上所述，GL能明显减轻肝脏的冷缺血损伤，其机制可能与抑制HMGB1-TLR4信号通路有关。但此结论需在临床试验中进行进一步验证。