罗 德 苏 松 刘向东 刘 江 陈鑫培 周鹏程 方 程 李 波

肝移植是目前终末期肝病唯一有效的治疗手段，但在手术中移植肝不可避免的要经历冷保存过程[1]。冷保存损伤一直是影响移植物功能及受者存活率的最重要因素之一[2]。如何最大程度地减轻冷保存损伤、提高移植物存活率是肝脏移植领域面临的巨大挑战。长链非编码RNA(long non-conding RNA，LncRNA)是指长度超过200个核苷酸，不具备蛋白质编码功能的RNA，大量研究表明其参与多种病理、生理过程[3]。目前LncRNA在肝冷保存损伤中的作用未见报道，本课题组前期通过建立小鼠肝脏冷缺血模型应用二代测序技术比较了LncRNA表达谱变化，发现TUG1在冷缺血组织标本中呈显著低表达，本研究旨在通过建立细胞冷保存模型来探讨TUG1对冷保存小鼠肝细胞的保护作用及其可能的机制[4]。

材料与方法

1.细胞与主要试剂：原代成年小鼠肝脏细胞(HC)、肝窦内皮细胞(LSEC)购买自武汉原生原代生物医药科技有限公司。小鼠乳酸脱氢酶(LDH)ELISA试剂盒、CCK-8试剂盒购于南京建成公司。TUG1慢病毒由上海吉玛制药技术有限公司生产。总RNA提取试剂盒购于美国Zymo Research公司，TUNEL试剂盒购于美国Sigma公司，EBM-2培养基、DMEM培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司。RIPA 试剂、BCA 试剂盒购自碧云天公司，Bax、Bcl-2、Cyt-C、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 和cleaved PARP一抗购于英国Abcam公司，GRP78、PERK、p-eIF2α、CHOP、cleaved-caspase 12和cleaved-PARP一抗购于美国CST公司。

2.实验方法：(1)细胞培养：HC采用添加10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基，LSEC采用EBM-2培养基，在37℃、5% CO2条件下培养。(2)小鼠肝脏细胞冷保存损伤模型建立：将培养的HC和LSEC在4℃的细胞培养基中培养12h，然后在37℃、5%CO2正常培养条件培养2h来构建细胞冷保存损伤模型。(3)TUG1表达的检测：利用Trizol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定样品浓度。取500ng总RNA为模板，利用oligo dT和随机引物合成cDNA，利用SYBRG reen染料法进行实时定量PCR反应。反应体系：20μl，含cDNA 2μl，引物5pmol，SYBR Green Master mix 10μl；反应条件：50℃ 2min；95℃ 15S、60℃ 1min 40个循环。结果用Ct值分析，以GAPDH基因作为内参，折算为相对倍数确定基因表达的相对变化。所用引物采用Primer 3软件设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列为：TUG1 上游引物：5′-GGCACCCAGTGTAAAGCA-3，下游引物：5′-AAGCAGCAGATAACAGAGTTGA-3′；GAPDH 上游引物：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游引物：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。(4)TUG1过表达慢病毒感染：感染前24h，将处于对数生长期的细胞以2×105个/孔的数量接种于6孔板中，每孔加入无抗生素的培养液2ml。按照病毒的感染复数等于20，将慢病毒与培养基混和均匀，后加入待感染细胞中。24h后换液，72h后荧光显微镜观察并计算转染效率。待细胞生长至汇合度为80%时，进行常规传代培养，用于后续实验。(5)肝脏细胞冷保存损伤指标的检测：采用CCK-8试剂盒检测细胞活性，ELISA试剂盒检测细胞培养液上清中LDH含量，细胞凋亡程度通过 AnnexinV-FITC凋亡试剂盒和流式细胞仪检测分析。(6)线粒体凋亡及内质网应激通路相关蛋白检测：利用蛋白质印迹法检测线粒体凋亡通路相关蛋白Bax、Bcl-2、细胞色素C、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 和cleaved PARP及内质网应激通路相关蛋白GRP78、PERK、p-eIF2α、CHOP、cleaved-caspase 12和cleaved-PARP的表达以确定线粒体凋亡通路及内质网应激通路的变化。具体方法为：利用RIPA试剂提取细胞总蛋白，BCA定量后取30μg蛋白，经聚丙烯凝胶电泳分离，经转膜 、封闭，抗体杂交后显影，通过Image J 扫描灰度值后计算相对水平。

结 果

1.TUG1在冷保存模型中表达下调:为了探索冷保存损伤模型中TUG1的表达变化，将HC和LSEC在4℃的细胞培养基中培养12h，然后在正常培养条件培养2h来构建细胞冷保存损伤模型，通过q-PCR检测TUG1的表达变化。如图1所示，与正常培养细胞比较，冷保存模型中TUG1的表达明显降低。

图1 冷保存12h TUG1表达情况A.HC组；B.LSEC组；与正常培养细胞比较，*P<0.05

2.过表达TUG1降低冷保存导致的细胞损伤:为了探索TUG1对冷保存损伤的影响，通过慢病毒感染的方式在HC和LSEC中过表达TUG1，如图2所示，与阴性对照比较，慢病毒感染后TUG1表达水平明显升高。建立细胞冷保存损伤模型，流式细胞技术检测细胞凋亡，如图3所示，与阴性对照组比较，TUG1高表达组的细胞凋亡明显降低。CCK-8法检测细胞活性，如图 4所示，高表达TUG1组细胞活性明显高于阴性对照组。通过检测细胞培养液中LDH变化来判断细胞损伤程度，如图5所示，TUG1高表达能减轻LDH释放。

图2 慢病毒感染后TUG1表达情况A.HC组；B.LSEC组；与阴性对照组比较，*P<0.01

图3 流式技术检测细胞凋亡A.HC组；B.LSEC组;与阴性对照组比较，*P<0.01

图4 CCK-8法检测细胞活性A.HC组；B.LSEC组;与阴性对照组比较，*P<0.01

图5 细胞培养液中LDH变化A.HC组；B.LSEC组;与阴性对照组比较，*P<0.01

3.过表达TUG1对线粒体凋亡及内质网应激通路相关蛋白表达的影响:为了探讨TUG1对冷保存损伤保护作用的潜在机制，首先通过Western blot法检测了线粒体凋亡相关蛋白的表达变化。如图6、图7所示，与阴性对照组比较，TUG1慢病毒组的Bax，Cyt-c，cleaved caspase-9，cleaved caspase-3，cleaved PARP表达明显降低，Bcl-2表达明显上升。接着检测了内质网应激相关蛋白的表达变化，结果如图8、图9所示，与慢病毒阴性对照组比较，慢病毒组GPR78、PERK、p-eIF2α、CHOP、cleaved-caspase 12和cleaved-PARP表达明显降低。

图6 Western blot法检测HC细胞线粒体凋亡相关蛋白与阴性对照组比较，*P<0.01

图7 Western blot法检测LSEC细胞线粒体凋亡相关蛋白与阴性对照组比较，*P<0.01

图8 Western blot法检测HC细胞内质网应激相关蛋白与阴性对照组比较，*P<0.01

图9 Western blot法检测LSEC细胞内质网应激相关蛋白与对照组比较,*P<0.01

讨 论

肝移植过程中供肝通常需要在2～8℃条件下保存数小时。低温能降低细胞代谢从而延长移植物保存时间[5,6]。但是，在冷保存期间，供肝N+-K+-ATP酶活性受到抑制，引起N+-Cl-内流增加、继发性胞内Ca2+失衡以及细胞水肿。同时，无氧代谢导致线粒体功能障碍和中性粒细胞激活，促使大量自由基产生并损伤血管内皮细胞和细胞死亡，被认为是术后移植物无功能的重要原因[7～9]。供肝短缺仍是肝移植领域中最根本的问题。有研究者认为“边缘供肝”是解决目前供肝短缺困境的有效途径之一，然而边缘供肝往往来源于老龄、伴发脂肪肝以及无心跳供体(nonheart-beating donors，NHBD)，对缺血再灌注及冷保存损伤的耐受性较差，原发性移植物无功能的发生率往往高于活体肝移植供体或脑死亡供体[1,2]。因此，对供肝冷保存采取必要的保护性干预措施，从而减小损伤、改善供肝质量是目前肝移植研究领域的热点课题之一。虽然目前对于冷保存损伤已有不少研究，但其分子机制仍不清楚。为此，本课题组前期通过建立小鼠肝脏冷保存模型，利用二代测序技术筛选出差异表达的lncRNA TUG1，并重点探究其在冷保存中的作用及其潜在机制。

LncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，参与细胞内多种生物学过程，但在肝脏冷保存损伤方面未见报道。牛磺酸上调基因1(lncRNA taurine up-regulated gene1，LncRNA TUG1)最初是在筛选牛磺酸处理的小鼠视网膜细胞基因组时被发现，其序列在哺乳动物中高度保守。研究发现在新生视网膜细胞中通过RNA干扰技术沉默TUG1可以通过增加细胞凋亡而导致光感受器的畸形或外段缺失[10]。最近研究表明TUG1影响多种肿瘤细胞的凋亡和增殖。研究发现TUG1在骨肉瘤中表达普遍上调，并调控骨肉瘤细胞的增殖和凋亡[11]。也有研究报道高TUG1的表达水平与膀胱尿路上皮癌的高分级和分期有关，沉默TUG1的表达水平导致细胞增殖抑制和凋亡诱导[12]。

已有研究显示，肝脏冷损伤始于HC和LSEC的损伤[13，14]。因此，本研究通过建立HC和LSEC冷保存损伤模型来探讨TUG1作用及其机制。本研究中发现，TUG1在冷保存的肝脏细胞中表达下调，这与本研究前期的动物实验结果一致[4]。当细胞通过慢病毒感染上调TUG1表达后，细胞凋亡及LHD水平明显降低，细胞活力增加，这说明TUG1对冷保存损伤具有保护作用。既往研究表明细胞凋亡受线粒体功能障碍与内质网应激信号途径调节[15～17]。本研究通过蛋白印迹实验比较了TUG1上调后细胞色素C、线粒体凋亡相关蛋白及内质网应激相关蛋白的表达变化来探讨TUG1降低冷保存损伤的可能机制。结果显示TUG1表达上调后，细胞色素C，线粒体凋亡相关蛋白及内质网应激相关蛋白的表达明显降低。综上所述，笔者推测LncRNA TUG1可能通过抑制线粒体及内质网应激通路降低细胞凋亡，从而降低细胞冷保存损伤。