赵 亮 孙丽芳 郑秀丽 刘静芳 郑 蓉 王 颖 杨 蕊 张 蕾 于 丽 张 晗

辅助生殖技术(ART)安全性一直广受关注，流行病学调查显示，即使经过混杂因素的调整，辅助生殖围产期合并症发生率高于普通人群，而不孕疾病因素虽然重要，但不是这些不良妊娠结局的主要因素，其病理生理机制是目前生殖医学领域的关键问题[1]。人类早期胚胎发育，需要囊胚外层滋养层细胞浸润子宫内膜将胚胎黏附,并侵袭和重建子宫血管，形成母胎循环。金属蛋白硫是一类富含半胱氨酸的低分子蛋白质，其基因位于16号染色体q13区域，主要位于细胞核、线粒体、内质网等细胞器，具有很强的重金属结合能力和清除氧自由基的功能，是胎盘组织重要的保护机制之一，金属蛋白硫在合体滋养层细胞表达高于细胞滋养层细胞，主要表达在细胞膜和细胞质中，在胚胎组织中广泛表达,对早期胚胎和胎盘发育具有重要作用[2]。本研究排除不孕因素，与自然妊娠相对照，对体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)来源的早期胎盘绒毛和胚胎组织金属蛋白硫基因和相关蛋白表达进行研究，探讨IVF-ET技术对该基因表达和功能影响，从胎盘和胚胎早期发育视角初步探讨辅助生殖安全性以及不良妊娠结局可能的病理生理机制。

对象与方法

1.研究对象:选取2014～2017年在北京大学第三医院生殖中心因为输卵管因素或者男性因素接受IVF-ET治疗患者，患者均是在新鲜周期取卵移植，因双胎妊娠减为单胎102例孕妇，选择其中IVF-ET移植术后双胎减胎的8例组织标本作为研究组(患者年龄23～35岁，平均年龄30.8岁)。102例患者双胎减为单胎的原因为：高血压等慢性疾病、子宫畸形、瘢痕子宫、子宫平滑肌瘤、宫颈机能不全、宫颈癌锥形切除病史或者患者要求。所有减胎术均由同一位高年资妇产科医生在阴道B超引导下施行，通过物理抽吸方法获得胚胎和胎盘绒毛组织，术前和术中不使用任何药物和激素。于胚胎移植后30～45天施行减胎术，相当于妊娠45～60天。对照组采用非计划妊娠10例(年龄24～30岁，平均年龄28.9岁)，所有患者月经规律，近3个月未使用激素类药物，经早孕实验和B超诊断宫内妊娠，胚胎和胎盘绒毛组织采用传统人工流产获得。研究获得笔者医院伦理学委员会审批通过(伦理审批号：2014075)

2.减胎体外受精-胚胎移植(IVF-ET)标本获取：超声监视下，阴道探头频率6.5MHz，排空膀胱，取膀胱截石位，常规消毒铺巾后，置入装有穿刺针导架的带有无菌探头套的阴道探头，了解孕囊大小、位置及相互关系，采用16G双腔穿刺针，沿超声穿刺引导线进针，穿过引导及子宫壁刺入胚体后，助手用20ml注射器抽吸胚胎组织，观察有胚胎组织吸出或残留胚胎无胎心搏动之后，在穿刺针退出的时候，在胚胎和子宫内膜交界处吸取胎盘绒毛组织。立即置于热台倒置显微镜下分离去除血、胚胎组织和其他杂质，纯化胎盘绒毛，立即送少量胚胎和绒毛组织到细胞遗传实验室进行核型检测，染色体正常组织才能应用进行后续研究。自然妊娠采用常规人工流产术，同样送少量胚胎和胎盘绒毛组织到细胞遗传实验室进行核型检测，术前不使用米索和激素等药物。

3.胚胎和胎盘绒毛组织处理：胎盘和绒毛组织置入磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后置入10%甲醛溶液中，4℃固定16h，PBS漂洗数次，经50%、70%、95%及无水乙醇逐级脱水后，以二甲苯透明。于58℃浸蜡过夜，次日更换石蜡并继续浸蜡4h，然后包埋。包埋好的蜡块置于4℃冰箱储存待用。采用Leica RM2135石蜡切片机切片，厚度6μm，展片于载玻片上42℃烘烤4天，然后密闭存放于4℃冰箱待测。

4.免疫组织化学：石蜡切片室温平衡后，二甲苯脱蜡，经无水乙醇、95%、70%及50%逐级水合后，蒸馏水清洗。于枸橼酸盐缓冲液中95℃微波热修复15min以暴露抗原。冷却至室温后1%H2O2室温孵育15min，以消除内源性过氧化物酶活性。PBA清洗，5%BSA封闭30min。鼠抗人AFP抗体(中山金桥生物公司，1∶400稀释)4℃孵育过夜。次日PBS清洗，辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG(中山金桥生物公司，1∶100稀释)室温孵育15min。PBS清洗，二氨基联苯胺(美国Dako公司)显色10min，自来水冲洗以终止显色反应。苏木精复染10s，自来水冲洗。经乙醇逐级脱水后，二甲苯透明，加拿大树胶封片。

5.免疫组织化学结果判定:免疫组化切片采用日本ECLIPSE 80i专业图像采集与分析系统(日本Nikon公司)进行半定量分析。在相同条件下对同一批染色切片进行观察、图像采集，通过NIS-Elements3.0软件对所采集的图像中阳性部位(细胞核和细胞质中棕黄色颗粒为阳性表达)进行吸光度(A)值的测定，每张胎盘绒毛和胚胎组织切片在400倍光学显微镜下随机选取表皮部位各5处，计算阳性表达的平均吸光度(A)。

6.qRT-PCR 检测：qRT-PCR 方法检验胎盘绒毛和胚胎组织基因表达。第一链互补合成反应采用PrimeScript反转录试剂盒(大连宝生物工程大连有限公司)。 qRT-PCR仪PRISM7300进行扩增反应(美国ABI公司)，GAPDH内参，qRT-PCR检测金属蛋白硫引物为5′-ACTGCTCCTGCGCCATGGTG-3′，5′-ATTATCATTCACATATTTCAT-3′，GAPDH引物为5′-AAGCCCATCACCATCTTCCAG-3′，5′-TCTTCTGACACCCATCGGGGA-3′。每个qRT-PCR 反应设3个复孔，重复3次，结果分析采用DDCt方法。

结 果

1.临床资料:两组妊娠妇女一般情况详见表1，年龄、停经时间、妊娠次数和体重指数方面比较，两组间比较差异无统计学意义。

2.金属蛋白硫在胎盘组织中表达:金属蛋白硫在早孕胎盘绒毛组织中，表达于绒毛内细胞滋养层细胞，合体滋养层细胞，细胞滋养层细胞柱，其中在IVF-ET组和自然妊娠组，均可见合体滋养层细胞表达高于细胞滋养层细胞。IVF-ET来源胎盘绒毛组织中金属蛋白硫表达吸光度(A)值为0.036±0.004，自然妊娠来源胎盘绒毛组织表达较强，吸光度(A)值为0.040±0.004，IVF-ET组胎盘绒毛组织金属蛋白硫表达低于自然妊娠组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图1。

表1 两组妊娠妇女一般情况比较

图1 金属蛋白硫在早期胎盘绒毛组织中表达情况A.金属蛋白硫在IVF-ET胎盘绒毛组织中表达(×100)；B.金属蛋白硫在自然妊娠胎盘绒毛组织中表达(×100)；C.金属蛋白硫在IVF-ET胎盘绒毛组织中表达(×400)；D.金属蛋白硫在自然妊娠胎盘绒毛组织中表达(×400)

3.金属蛋白硫在胚胎组织中表达：金属蛋白硫在IVF-ET组和自然妊娠早期胚胎组织中具有广泛表达，其中IVF-ET组和自然妊娠组胚胎组织中金属蛋白硫表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见图2。

图2 金属蛋白硫在早期胚胎组织中表达情况A.金属蛋白硫在IVF-ET胚胎组织中表达(×50)；B.金属蛋白硫在自然妊娠胚胎组织中表达(×50)；C.金属蛋白硫在IVF-ET胚胎组织中表达(×200)；D.金属蛋白硫在自然妊娠胚胎组织中表达(×200)

4.qRT-PCR检测结果：qRT-PCR检测金属蛋白硫mRNA在早孕胎盘绒毛和胚胎组织中表达，结果显示，IVF-ET胎盘绒毛组织中金属蛋白硫mRNA低于自然妊娠组，差异有统计学意义(P<0.05)。IVF-ET组和自然妊娠组胚胎组织中，金属蛋白硫 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 金属蛋白硫 mRNA在胎盘绒毛和胚胎组织中表达情况*P<0.05

讨 论

辅助生殖技术广泛应用于临床，其引起子代风险性增高的潜在机制值得深入探讨。研究对1222例单纯促排卵治疗、554例IVF-ET妊娠以及34286例自然妊娠出生单胎的妊娠结局进行分析，发现当匹配年龄、种族、教育程度、BMI、吸烟史以及既往早产史之后，辅助生殖技术明显增加先兆子痫、前置胎盘、胎盘早剥等胎盘发育相关的妊娠并发症风险[3]。针对辅助生殖中单胎移植的不良妊娠结局问题并对单胎移植妊娠结局进行Meta分析，发现即使排除多胎移植的影响，辅助生殖单胎移植的妊娠结局与自然妊娠单胎比较仍然较差，而深入的病理生理机制不清楚[4]。对欧洲辅助生殖妊娠结局数据进行分析，单胎移植的不良妊娠结局发生率是32%，而不孕疾病因素虽然重要，但并不是这些不良结局的主要因素，相关病理生理机制尚不清楚[5]。

本研究对IVF-ET来源的胎盘绒毛和胚胎组织金属蛋白硫基因和蛋白表达进行分析，与自然妊娠比较，发现在IVF-ET来源胎盘绒毛组织低表达金属蛋白硫，而IVF-ET来源胚胎组织中金属蛋白硫表达未见明显差异，qRT-PCR结果显示金属蛋白硫基因IVF-ET组胎盘绒毛相比对照组表达降低，IVF-ET胚胎组织与对照组比较差异无统计学意义，与免疫组织化学研究结果一致。金属蛋白硫是胎盘内源性抗损伤物质，作为一种多功能蛋白质其作用包括重金属解毒，必需金属元素的平衡调节，稳定细胞膜、清除自由基、抑制脂质过氧化反应，减轻钙超载、DNA损伤保护，并与血管再生，细胞存活，凋亡和增殖有关。参与胎盘局部应激反应、滋养层细胞发育、细胞代谢调控、内分泌调节等，保护细胞免受外界刺激的损伤和对抗亲电子物质[6]。本研究发现与自然妊娠比较，IVF-ET早期胎盘滋养层细胞中低表达金属蛋白硫，显示IVF-ET技术操作或者药物等影响胎盘滋养层细胞早期发育和功能，干扰金属蛋白硫表达，进而在诸多功能方面影响滋养层细胞功能。 IVF-ET来源滋养层细胞低表达金属蛋白硫，会影响滋养层细胞内部微量元素平衡，包括微量元素的储存、运输和代谢。相关研究表明，金属蛋白硫是锌储存蛋白，可以与细胞内游离锌结合，调节锌水平，参与锌的储存、运输及生物利用，维持体内锌、铜平衡，在锌代谢中有重要作用[7]。本研究结果显示，IVF-ET技术影响胎盘组织锌动态平衡进而影响其功能。金属蛋白硫对重金属具有解毒作用，其特殊分子结构和金属亲和力，使得其结合有毒游离金属离子，缓解重金属毒性和转运金属离子到肝脏、肾脏器官进行解毒和排除[8]。

本研究发现，金属蛋白硫在IVF-ET早期胎盘组织中细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞均有较低表达，并且经qRT-PCR验证其基因表达与组织化学结果相一致。金属蛋白硫一个重要功能是清除自由基，金属蛋白硫的巯基在自然状态下是以还原形式存在，因此具有亲核性，容易与某些亲电子物质包括自由基相结合，具有很强的抗氧化活性，是拮抗各种活性氧和活性氮所致氧化损伤的抗氧化剂，从而及时清除尚未损伤到靶细胞的自由基。妊娠早期胎盘滋养层细胞代谢旺盛，氧代谢产生的自由基增加由此引发的脂质过氧化反应增强，人体内存在自由基产生与清除的酶系统，本研究结果显示IVF-ET来源早期胎盘滋养层细胞抗氧化能力和自由基清除能力下降，而滋养层细胞本身是与外界直接接触，并且在IVF-ET技术中直接接触药物和受到操作的细胞，其抗氧化损伤能力下降直接影响胎盘发育和功能[9]。研究表明，锌离子可以增加金属蛋白硫的表达，锌离子的剂量与金属蛋白硫的表达量呈正相关，可以增加重金属离子和氧化应激对细胞毒性作用。相关研究中确实发现，增加饮食补充锌离子，可以提高IVF-ET技术成功率，但是锌离子的其他作用和机制尚不清楚，鉴于胎盘复杂调节网络和强大代偿功能，金属蛋白硫在IVF-ET中对滋养层细胞功能影响和相关发病机制，还有待进一步研究支持[10]。

本研究发现，与自然妊娠组比较，IVF-ET组胎盘绒毛组织金属蛋白硫低表达，IVF-ET组和自然妊娠组胚胎组织中金属蛋白硫蛋白和基因表达比较，差异无统计学意义。研究结果显示，相比较胚胎，辅助生殖技术倾向于影响胎盘功能，与动物模型研究结果一致[11]。以牛为模型研究，发现体外受精-胚胎移植牛早期胎盘血管的密度显著减少，并伴有VEGF mRNA表达的减少，推测晚期胎盘结构变化是对缺血、缺氧的代偿反应[12]。以小鼠为模型，发现辅助生殖技术可能导致滋养层细胞侵袭能力下降和对子宫螺旋动脉重塑不足，是子代小鼠低出生体质量和早产的危险因素[13]。辅助生殖技术对胎盘的影响也表现在足月胎盘组织中，认为胎盘血管形成异常是辅助生殖技术妊娠风险的原因之一，同时利用电镜观察发现辅助生殖技术胎盘屏障厚度增加，终末绒毛顶端微绒毛减少和完全消失[14，15]。

综上所述，胎盘作为妊娠期重要的多功能器官，可能是辅助生殖过程中多种影响因素的靶器官，对人辅助生殖早期胎盘中滋养层细胞功能的深入、全面、系统研究，阐明胎盘功能变化的病理生理过程与分子机制，探寻干预措施，将有利于提高辅助生殖技术安全性。