1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；2.华北理工大学中医学院，河北 唐山 063210；3.北京中医药大学基础医学院，北京 100029

甲型H1N1流感病毒最早于2009年4月在墨西哥爆发[1]，随即在全球范围内蔓延。世界卫生组织初始将此型流感称为“人感染猪流感”，后将其更名为“甲型H1N1流感”。2009年6月11日，世界卫生组织将甲型H1N1流感警戒提升为6级，同年，中国明确将甲型流感病毒H1N1纳入乙类传染病，并采取甲类传染病的预防和控制措施[2]。流感病毒具有易变异性和易传染性，免疫力低下的人群更易受到攻击[3]，因此，探寻兼具调节机体免疫功能的抗流感性肺炎药物显得尤为重要。喘可治注射液由淫羊藿、巴戟天组成，具有抗过敏、增强体液免疫与细胞免疫的功能，研究发现喘可治注射液还表现出一定的抗炎作用，可以减少细胞炎性因子TNF-α、IL-β、IL-18等的分泌，减轻大鼠肺叶局部炎症反应[4]。本研究通过建立免疫低下病毒性肺炎动物模型，对喘可治注射液防治流感的药效学作用进行评价。

1 材料

1.1 动物及病毒株 ICR小鼠，SPF级，体重(14±1)g，雌雄各半，购自北京维通利华试验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2006-0009。甲型H1N1流感病毒鼠肺适应株(FM/1/47株)，购自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制研究所，由本所ABSL-2试验室传代，-80 ℃保存备用。

1.2 药品及试剂 喘可治注射液，广州健心药业有限公司，国药准字Z20010172，批号20080905059，规格2 mL/支；达菲(磷酸奥司他韦胶囊)，瑞士巴塞尔豪夫迈·罗氏有限公司产品，上海罗氏制药有限公司分装，批号B1162，分装批SH0033;注射用环磷酰胺：批号20090103，山西普德药业有限公司产品；乙醚，北京试剂公司产品，批号20090707。

1.3 仪器 Applied Biosystems 7500型定量PCR仪，美国应用生物系统(ABI)公司产品；TC-96/G/H(b) 梯度PCR仪，博日科技有限公司产品；HC-3018R高速冷冻离心机，中科中佳公司产品；MSC1.8型A2型生物安全柜，德国Thermo产品；YP/0001型动物体重电子天平，上海越平科学仪器有限公司产品；AR1140型动物脏器电子天平，美国Chaus产品。

2 方法

2.1 给药剂量设计 喘可治注射液成人临床常规用量为8 mL/60 kg/d，试验时小鼠用量为1.5 mL/kg/d(相当于人临床用药量的等效剂量)，试验时按等容不等浓0.2 mL/10 g腹腔注射给药。达菲临床用量为150 mg/60 kg，换算为小鼠等效剂量为27.5 mg/kg/d，按0.2 mL/10 g灌胃给药。

2.2 病毒株处理甲型H1N1流感病毒(FM1株)，本室常规鸡胚传代，TCID50为1×10-4.5，-80 ℃冰箱保存。

2.3 流感病毒H1N1感染致小鼠肺炎模型 除正常对照组外，其余组小鼠按10 mL/kg皮下注射环磷酰胺(10 mg/kg)，每日1次，共2天，造成免疫低下模型[5]。除正常对照组、环磷酰胺组外，其余组小鼠用乙醚轻度麻醉，以15个LD50病毒液(FM1株)滴鼻感染，每只35 μL，造成免疫低下病毒性肺炎小鼠模型[3]。

2.4 分组及给药 ICR小鼠随机分为5组，分别为正常对照组、环磷酰胺对照组、模型对照组、达菲对照组(灌胃给药)、喘可治注射液组(腹腔注射给药)，每组10只。治疗性实验：感染当天开始给药，每天1次，连续4 d，第5天后称重，处死小鼠，检测各指标。预防实验：各组给予相应的药物，每天1次，连续5 d，给药第5天后，除正常对照组外，其它组小鼠用乙醚轻度麻醉，以15个LD50流感病毒液FM1株滴鼻感染，感染第4天后，称重，处死小鼠，检测各指标。

2.5 引物设计与合成 引物设计：利用Primer Premier 5.0软件进行序列分析并设计引物，所设计引物的Tm值、GC含量及3′末端稳定性等基本参数依据引物优化原则。

引物合成：由上海英骏公司合成。针对流感病毒(H1N1)基因序列的上下游引物序列见表1。

表1 引物序列

2.6 Real-time RT-PCR扩增 用液氮研磨肺组织后，使用Trizol提取肺组织中的RNA，用上述H1N1和GAPDH引物进行实时荧光定量聚合酶链式反应，反应体积为20 μL，反应体系含样本RNA 2 μL。反应条件为：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。反应结束后分析各检测样本Ct值。

2.7 计算方法 肺指数=肺湿重(g)/体重(g)；脾指数=脾湿重(g)/体重(g)；胸腺指数=胸腺湿重(g)/体重(g)；肺指数抑制率=(病毒对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/(病毒对照组平均肺指数-正常对照组平均肺指数)×100%。

病毒载量计算方法：使用相对定量的方法，以GAPDH作为内对照，选择一个样品(Con)作为 Calibrator，计算方法如下：

ConΔCt=Con Ct-Con GAPDH Ct

样本ΔCt=样本Ct-样本GAPDH Ct

样本ΔΔCt=样本ΔCt-ConΔCt

2-ΔΔCt是各处理组基因表达相对Calibrator的倍数改变。

相对含量的变化=2-ΔΔCt×100%

病毒载量抑制率=(病毒对照组病毒载量均值-实验组病毒载量均值)/病毒对照组病毒载量均值×100%。

3 结果

3.1 喘可治注射液对甲型流感病毒H1N1感染免疫低下小鼠肺炎模型的治疗作用 甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫低下小鼠后，肺指数增高，脾、胸腺指数降低，三者与环磷酰胺组比较差异均有显著性意义(P<0.01)。达菲对照组肺、脾、胸腺指数与模型对照组比较差异均有显著性意义(P<0.01)。喘可治注射液组脾、胸腺指数升高，脾指数与模型对照组比较有显著性意义(P<0.05)；喘可治注射液组肺指数有所降低，但与模型对照组比较无显著性意义(P>0.05)。

表2 喘可治注射液对FM1株流感病毒免疫低下小鼠肺炎的治疗作用

注：与环磷酰胺对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，**P<0.01

3.2 喘可治注射液对甲型流感病毒H1N1感染免疫低下小鼠肺炎模型的预防作用 采用甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫低下小鼠后，肺指数明显增高，与环磷酰胺对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)；感染前预防性给予临床等效剂量的喘可治注射液4 d，可明显降低肺指数，与模型对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)。

预防性给预喘可治注射液可明显降低小鼠肺组织中FM1株流感病毒病毒载量，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，病毒载量抑制率可达58.68%。

表3喘可治注射液对FM1株流感病毒感染免疫低下小鼠肺炎的预防作用

组别剂量肺指数抑制率/%病毒载量抑制率/%正常对照组-0.62±0.06---环磷酰胺对照组-0.70±0.07---模型对照组-1.56±0.50##-1517839.97±391122.94-达菲对照组27.5mg/kg1.10±0.18**54.13376923.34±26710.71**75.17喘可治注射液1.5mL/kg0.93±0.18**73.59627217.53±31385.04**58.68

注：与环磷酰胺对照组比较，##P<0.01；与模型对照组比较，**P<0.01。

4 讨论

环磷酰胺是目前临床常用的一类经典广谱抗肿瘤药物，但其有明显的细胞毒性，治疗过程中往往会杀伤体内增生活跃的免疫细胞，致使机体免疫低下，甚至免疫紊乱[5]，因此，该药常常被用来制备免疫低下动物模型。应用环磷酰胺造成免疫低下小鼠模型，操作简便，是动物实验中比较常用的一种方法[6-7]。甲型H1N1流感病毒属于正粘病毒科A型流感病毒，携带有H1N1亚型猪流感病毒毒株包含禽流感、猪流感及人流感三种流感病毒的核糖核酸基因片断，尽管不同亚型之间可以组成很多种流感病毒血清型，但是可造成人感染猪流感病毒的血清型主要有H1N1、H1N2和H3N2[8]，其中H1N1占的比例最大，因此，本实验采用甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫低下动物造成肺炎模型。

当流感病毒在肺脏支气管上皮细胞和肺组织中大量增殖时，可引起严重的病理组织损伤，如肺部水肿、炎性渗出、充血等，导致支气管炎和间质性肺炎[9-10]，这些病理改变均可使肺脏重量增加，肺指数值越大，表示肺组织病变程度越严重，因而，肺指数可用来评价肺组织病变程度。而对病毒载量相对定量的分析，可表现出病毒复制动力学[11]，也反映肺组织中病毒的浓度，是病毒增殖和免疫清除机制共同作用的结果[12]，因而，在判定疾病进程和临床治疗效果上具有极大的价值[3]。

本研究成功建立了流感病毒感染免疫低下小鼠肺炎模型，以肺指数和病毒载量为评价指标，观察喘可治注射液对甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫功能低下小鼠的防治作用，并与我国卫生部推荐的治疗流感主要药物达菲进行了比较研究，实验结果显示，治疗性给予喘可治注射液后，小鼠脾指数则升高明显，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01)，小鼠肺指数虽有明显的降低趋势，但与模型对照组比较无显著性差异(P>0.05)。预防性给予喘可治注射液后，肺指数及肺组织中毒病毒载量均明显降低，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01)，病毒载量抑制率达58.68%。以上数据证实，喘可治注射液对甲型H1N1流感病毒有明显的抑制或杀灭作用，同时还具有免疫调节作用，可改善和提高机体的免疫功能，对感病毒感染免疫低下小鼠肺炎模型防治作用明显。本研究为其临床应用提供了实验依据，为今后免疫低下病毒性肺炎的药效评价和免疫致病机制研究提供方法学参考。