张文超，张强，岳玖玲，卓姗姗，潘毅，张仑

喉癌以鳞癌为主，5年生存率为50%～70%，声门上癌占喉癌的45%～50%［1］，对于局部进展期（T3～4，N0～2，M0）声门上癌，临床常采用诱导化疗来控制肿瘤局部生长，达完全缓解（CR）、一些部分缓解（PR）病例可行同步放化疗，化疗效果不佳者行手术治疗。经过诱导化疗会形成“肿瘤退缩区”，给术中判断肿瘤的范围及边缘带来困难。有研究认为某些标志物与喉癌安全边界相关，其中真核翻译起始因子4E（eIF4E）是翻译启动因子复合体关键部分，在很多肿瘤组织中100%表达，而在正常喉黏膜中呈阴性表达［2］；生存素（survivin）是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，在喉癌中也呈高表达，而在息肉及正常组织中无表达［3］；细胞周期蛋白D1（cyclinD1）过表达可使细胞不停地进入细胞周期，由高到低在喉癌、乳头状瘤中表达［4］；P27在细胞周期中起负性调节作用，在喉癌、乳头状瘤、正常黏膜中表达逐渐升高［5］。目前对于化疗后的手术切缘界定以及通过组织芯片（TMA）技术同时检测喉癌相关的4种标志物与切缘的关系国内外鲜有报道。本文通过TMA 技术检测上述标志物在肿瘤退缩后不同距离的癌旁最短切缘组织中的表达，结合与局部复发率的相关性，确定安全切缘的生物学指标，探寻一种更为准确的喉癌化疗后手术切缘判定方法。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床资料 回顾性分析2011年5月—2014年11月天津医科大学肿瘤医院头颈科收治的95例（总体组）进展期声门上喉癌（T3～4，N0～2，M0）患者的临床病理资料，其均行诱导化疗，临床、随访资料完整。其中CR 12例，PR 54例，病情稳定（SD）24例，疾病进展（PD）5例，化疗有效率（CR+PR）为69.5%（66/95）。排除12例CR病例和19例PR病例进一步行放化疗而未行手术者，以及5例PD病例理论上无“肿瘤退缩区”者。最终纳入59例经过2 个周期诱导化疗+手术治疗、标本保存完好且标本蜡块有充足瘤缘的喉癌患者为研究对象，男54例，女5例；年龄43～72岁，中位年龄61岁。按国际抗癌联盟UICC（2002）TNM分期标准：均为声门上型，Ⅲ期49例（T3N0M0 11例，T3N1M0 38例），Ⅳ期10例（T4N1M0 8例，T3N2M0 2例）。术式：水平半喉切除 54例，3/4 喉切除4例，次全喉切除1例。术后病理检查均确诊为鳞状细胞癌，切缘未见癌细胞；组织学分级高分化32例，中分化24例，低分化3例。以往的临床经验认为未化疗的喉癌外科切缘应达到5 mm 以上相对安全［6］，因此本研究按距肿瘤最短切缘（Margin）每5 mm 分为一档：＜5 mm（Margin 1）14例、5～10 mm（Margin 2）17例及＞10 mm（Margin 3）28例，共3组。

1.1.2 临床治疗 所有患者术前均接受诱导化疗，未接受放疗，采用TPF 方案，多西他赛+顺铂+5-氟尿嘧啶（5-FU）2周期，间隔21 d。具体方案：第1天静脉滴注多西他赛60 mg/m2+顺铂 80 mg/m2，第 2～5 天静脉泵注 5-FU 750 mg/m2。化疗结束后4周，依实体瘤疗效评价标准（RECIST1.1）［7］评估治疗效果，根据化疗前后喉镜及强化CT 结果统计CR、PR 率。并行手术治疗。

1.2 组织芯片的制备组织芯片制备系统及空心蜡模、石蜡块制备及蜡芯取材与点样由西安艾迪生物科技有限公司完成。每组选取2 张石蜡块，范围45 mm×25 mm，组织阵列仪（MTA-1，美国Beecher）打出间距合适、直径1.5 mm，深度为3～4 mm的孔，排列成8×9阵列。先将所有病例的供体蜡块水平切片，根据切片苏木精-伊红（HE）染色镜检结果进行标记，观察记录癌灶距切缘的最短距离，在蜡块上沿最短切缘方向定向取材，选定有代表性的癌巢、距原发癌最短距离边缘（最短切缘）共2个标记，用组织阵列仪细针获取同直径组织块，挤压到已打好的石蜡块孔里，制成排列有59例原发瘤（T）、最短切缘（Margin）组织芯片蜡块，2 张组织芯片共容纳59×2=118个阵列。术中已对切除肿瘤时保留的黏膜切缘行常规病理检测无癌细胞残留，取喉正常黏膜组织作对照。按同样方法组建另一组病例和阵列相同的2张组织芯片蜡块于4 ℃密封保存，以备重复实验。

1.3 免疫组化染色

1.3.1 主要材料 鼠抗人p27单克隆抗体（ZM0340）、兔抗人cyclinD1单克隆抗体（ZA0101）购自北京中杉金桥公司，鼠抗人eIF4E 单克隆抗体（sc9976）及兔抗人survivin 多克隆抗体（sc10811）均购自Santa Cruz Biochemology，Inc。

1.3.2 实验方法组织芯片用SP 法行eIF4E 及P27 免疫组化染色［8］，ABC 法行survivin、cyclinD1 免疫组化染色［9］，实验步骤：室温脱蜡，水化组织切片，蒸馏水、PBS 各3 次，予以抗原热修复；分别加入上述4种一抗工作液过夜孵育，PBS漂洗后加入生物素标记的二抗工作液（ABC法PBS漂洗后加ABC试剂，孵育），PBS漂洗后DAB染色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS 代替一抗作为阴性对照，已知的阳性切片作为阳性对照。每个检测指标均在另一张组织芯片上重复1次。

1.3.3 结果评定 免疫组化染色结果由2名副主任医师以上病理医师采用盲法对该组病例独立进行评判。eIF4E蛋白定位于细胞质，以肿瘤胞质出现明显深棕黄色颗粒为阳性着色；CyclinD1、P27 蛋白均定位于细胞核，无背景着色情况下以细胞核中出现明显棕黄色颗粒者为阳性着色；survivin 在胞质、胞核均可有阳性着色。评判标准：eIF4E、survivin 的表达：随机读取10个高倍（×400）视野，按照5%的界值确定2种标志物在外科切缘基底细胞层细胞的表达水平，如果＞5%的上皮细胞观察到着色即判断为阳性［10］；cyclin D1、P27 的表达：如果＞30%的上皮细胞核着色即判断为阳性［11］。

1.4 安全切缘的评价 光镜下观察每个病例肿瘤退缩区和最短切缘区的细胞形态及上述标志物表达情况，比较不同最短切缘与喉癌术后3年局部复发率的关系，评价手术安全切缘。

1.5 随访 随访期自2011年5月—2018年5月，患者术后每半年定期复诊随访，所有患者术后随访期均达到36个月以上或至患者死亡，中位随访期42个月，无失访。随访时行纤维喉镜及CT检查并记录喉内情况及有无原位局部复发。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0 进行统计学分析，计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验及Fisher 精确概率法分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织芯片阵列及染色结果 排列有59例原发瘤（T）、最短切缘（M）组织芯片蜡块，每行阵列以T开始，每对T、M组织相邻排列，依次类推。2张组织芯片共容纳59×2=118个阵列，见图1；每个阵列组织取材完整，免疫组化染色可靠，见图2；高倍镜下见免疫组化阳性染色组织定位准确，见图3。

Fig.1 Tissue microarray图1组织芯片阵列

Fig.2 Immunohistochemical staining of margins in tissue microarray under low magnification microscopy（P27,×40）图2 低倍镜下单个组织芯片阵列图（P27染色，×40）

2.2 肿瘤退缩区光镜下表现 疗效为PR、SD 病例均可形成镜下肿瘤退缩区，SD病例肉眼下退缩区可能不明显，仅镜下可见。与术前相比，术中肉眼可见化疗后肿瘤可呈同心圆似的整体向心性退缩，有3例梨状窝内侧壁肿瘤可完全消失而呈纤维化、硬化状态（图4A）；肿瘤退缩区镜下改变：组织结构不清，细胞形态消失，肿瘤细胞变性、坏死，被纤维组织分隔成多个细胞岛（图4B）。有的呈大片状坏死，仅可见残余瘤细胞岛。肿瘤退缩坏死区免疫组化染色多为阴性（图4C）。

2.3 肿瘤退缩后不同距离最短切缘的光镜下结果比较 原发瘤化疗后可见坏死及肿瘤退缩；不同切缘组术中常规病理检查切缘均阴性。Margin 1组切缘中10例含有肿瘤退缩区（10/14），可见坏死变性的瘤细胞；Margin 2组切缘中不含肿瘤退缩区，有2例不典型增生（2/17）；Margin 3组切缘不含肿瘤退缩区（0/28），呈增生及正常黏膜上皮，见图5。

2.4 不同切缘组eIF4E、survivin、cyclinD1、P27 的表达差异组织芯片免疫组化染色显示，eIF4E、survivin 在原发瘤T 高表达，3 个切缘组的阳性表达率随切缘增大急剧下降，除T组与Margin 1组差异无统计学意义外，其余组间多重比较差异均有统计学意义。各组cyclinD1、P27的阳性表达率差异均无统计学意义，见表1。

Tab.1 The positive expressions of eIF4E,survivin,cyclinD1 and P27 in different margin groups表1 不同切缘组eIF4E、survivin、cyclinD1、P27的阳性表达例（%）

2.5 不同切缘组局部复发率比较 59例喉癌患者中术后3年复发12例（20.3%），其中Margin 1组11例（78.6%），Margin 2组1例（5.9%），Margin 3组0例，3组3年复发率差异有统计学意义（χ2=38.643，P＜0.05），Margin 1组明显高于 Margin 2 和 Margin 3组（P＜0.05），Margin 2 与Margin 3组间差异无统计学意义。

3 讨论

外科手术是目前局部进展期喉鳞癌主要的治疗方式，且治疗重心由提高生存率转移到兼顾喉功能的保留，国内医院部分喉切除率较高［12］。对于局部T3以上进展期声门上病变，临床常采用TPF 方案术前诱导化疗来控制肿瘤局部生长，降低临床分期［13］。规范化疗后疗效达到CR、PR 的病例可选择同步放化疗继续治疗，疗效SD的患者建议手术，部分PR患者仍有强烈的手术愿望［14］。本研究严格按照规范要求选择经过2 周期诱导化疗后疗效SD 的24例及疗效PR中一部分不接受放化疗的患者实施手术。

接受术前诱导化疗后的病例中，术中可见呈浸润性生长的肿瘤发生向心性消退，肿瘤体积缩小，区域中组织结构不清，细胞形态消失，经镜下证实部分肿瘤周边转化为“正常”组织，成为“肿瘤退缩区”［15］。即使疗效评价为SD的病例，光镜下也可以出现肿瘤坏死之后形成的退缩区，只是退缩程度小于CR、PR［16］，这给术中判断肿瘤的范围及边缘带来困难。当诱导化疗后少量变性的癌细胞或微癌灶只存在于肿瘤退缩区或切缘区域时，常规病理学检查不可能对切缘组织的全部切片逐片观察，极易造成漏检。在病理学诊断为切缘阴性的患者中，仍有10%～30%的病例出现了局部复发［17］，因此诱导化疗后形成肿瘤退缩区，使手术切缘更加难以判断，也会对术中冰冻判断切缘是否无瘤造成影响，留下局部复发的隐患。

在未经化疗直接手术者，经验主张切缘最少达到5 mm，而目前文献中切缘的名称也不一致，有外科切缘、阴性切缘、干净切缘、分子切缘等［6］，具体切除范围缺乏基本的实验依据和理论支持，仅停留在凭术者经验判断切缘是否安全的水平，不可避免对治疗效果造成影响。本研究中声门上喉切除后最短切缘是基于对术后标本的测量，因为距离肿瘤最短的切缘是喉内局部复发的重要影响因素，而声门上癌切除范围相对较大，切缘组织丰富，研究组可以取到标本理想的最短切缘。

肿瘤在细胞形态发生明显变化之前，可出现癌基因表达增强，也可能出现抑癌基因的下降［18-19］，诱导化疗后不同标志物的表达也可能出现改变，但诱导化疗后手术的喉癌切缘的标志物研究尚少见相关报道。本研究选取的eIF4E、survivin、cyclinD1、P27是研究较多的几种与喉癌手术切缘、侵袭性及预后相关的标志物，可能在不同切缘表达梯度呈现递增或递减的趋势，与喉癌分子边界确定有关。与常规的免疫组化方法相比，本研究利用组织芯片技术可以多指标、高通量地对诱导化疗后肿瘤退缩不同距离的最短切缘基因异常表达进行检测。结果显示，胞核着色为主的cyclinD1 与P27 在各切缘长度组呈现相反的变化趋势；前者表达水平随切缘距离的增加而降低，后者表达随切缘距离的增加而升高，但尚未形成有统计学意义的表达趋势，不适合作为切缘标志物；eIF4E、survivin原发灶高表达，Margin 1组表达降低，但部分切缘可见肿瘤退缩区，易引起局部复发，3年局部复发主要集中在Margin 1组，占78.6%；Margin 2组表达极低，未见明显退缩区，3年局部复发率仅占5.9%；在Margin 3组无阳性表达，也未见肿瘤退缩区及3年局部复发，提示eIF4E、survivin 是比较敏感的分子切缘指标；进展期声门上癌化疗后10 mm以上的距离是相对安全的切缘，化疗后肿瘤有所退缩，应该适当扩大手术切缘范围，达到基本切除肿瘤退缩区，加之标志物表达阴性，使切缘更安全。

总之，声门上喉癌术后局部复发是治疗失败和影响患者预后的重要原因，喉功能保留手术切缘的掌握非常重要。诱导化疗后肿瘤退缩，有利于实施部分喉切除术，通过组织芯片技术高通量地对化疗后喉癌手术切缘处基因趋向表达进行检测和分析，eIF4E、survivin 可能作为评价诱导化疗后声门上喉癌切缘安全性比较敏感的标志物，其阴性表达的10 mm以上的外科切缘有利于肿瘤退缩后的切缘安全。

Fig.3 Immunohistochemical positive staining of four markers in laryngeal squamous cell carcinoma under high magnification microscopy（×400）图3 高倍镜下4种标志物在喉癌原发灶（T）中的免疫组化阳性染色（×400）

Fig.4 Tumor retraction mode microscopy and IHC staining after chemotherapy（×100）图4 化疗后肿瘤退缩模式镜下表现及免疫组化染色（×100）

Fig.5 The shortest margins of tumor retraction area after chemotherapy图5 化疗后肿瘤退缩区最短切缘