王幸，曾慧林，张祥贵，汤杰印

狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）严重并发症之一，也是其死亡的主要原因。目前认为LN的发病主要是肾脏细胞增殖与凋亡失衡（表现为增殖过度，凋亡不足）所致［1］。商陆皂苷甲（esculentoside A，EsA）是从中药商陆中提取出的主要成分之一，具有抗炎、免疫调节、抑制细胞增殖和促凋亡的作用［2］。课题组前期研究发现EsA 能显著改善LN 小鼠的尿蛋白及肾脏病理表现，随后对其机制进行探讨，发现EsA 可抑制辅助性 T 细胞 17（T helper cell 17，Th17）的分化，从而降低白细胞介素（IL）-17 的表达，抑制IL-17 诱导的肾小球系膜细胞增殖［3-7］。iTr35（CD4+Foxp3-IL-12p35+IL-27EBI3+）细胞是最新发现的调节性T细胞亚群，由IL-35诱导人或小鼠初始T细胞转变而成，具有强大的免疫抑制功能［8-9］，通过分泌特征性细胞因子IL-35发挥作用。IL-35是IL-12家族成员之一，由p35 亚基和EB 病毒诱导基因3（Epstein-Barr virus-induced gene3，EBI3）亚基组成的异源二聚体（IL-12p35/IL-27EBI3），在体内外均可抑制 Th17 细胞的分化，减少 IL-17 的分泌［10-11］。课题组前期体外实验发现EsA 对IL-17 有抑制作用，因此，本次实验以MRL/lpr 狼疮肾炎模型小鼠为研究对象，观察EsA 对MRL/ipr 小鼠体内IL-35、IL-17及iTr35表达的影响，从体内实验进一步证实EsA对IL-17的作用，明确EsA对IL-17的抑制是否通过IL-35来调节。

1 材料与方法

1.1 实验材料 （1）实验动物。16周龄雌性MRL/lpr小鼠24只，体质量（25±2）g，由美国Jackson 实验室提供，动物许可证：SCXK（苏）2016-0010。（2）药品与试剂。商陆皂苷甲（纯度＞98%，编号SE8230）、HE 染色试剂盒（编号G1120）、Masson 染色试剂盒（编号G1345）购自北京索莱宝科技有限公司；RPMI 1640 培养液（编号TBD724000）购自武汉华联科生物技术有限公司；IL-12p35单克隆抗体（编号MAB1570）购自R & D公司；尿蛋白检测试剂盒（编号CO35-2）、肌酐测定试剂盒（编号CO11-2）购自南京建成生物科技有限公司；IL-35酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（编号MU33024）、IL-17 ELISA 试剂盒（编号MU30074）购自武汉贝茵莱生物科技有限公司；APC anti-mouse CD4（编号110412）购自BioLegend公司；Anti-Mouse FOXP3 FITC（编号8341250100）购自Biogems公司；IL-12 p35 单克隆抗体FITC（编号MA5-23683）、IL-27单克隆抗体PE（编号MA5-23651）购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药 取16周龄MRL/lpr小鼠24只，采用随机数字表法将小鼠分为模型对照组、EsA组和EsA+IL-12p35抗体组，各8只。模型对照组每日腹腔注射RPMI 1640培养液 0.2 mL，共 4 周；EsA组腹腔注射 EsA 溶液（20 mg·kg-1·d-1）0.2 mL，共 4 周；EsA+IL-12p35 抗体组腹腔注射 EsA溶液（20 mg·kg-1·d-1）0.2 mL，共4周，在首次注射EsA溶液后注射IL-12 p35 抗体（2.5 mg/kg）1 次。所有小鼠在 SPF 条件下的独立通风笼中饲养，室内温度、湿度恒定，定期更换无菌笼具、垫料和饮用水等。根据体质量调整饮食量，自由进水。

1.2.2 尿蛋白/肌酐值检测 实验结束后用按压膀胱法收集尿液，考马斯亮蓝（CBB）法检测尿蛋白浓度、肌氨酸氧化酶法检测尿肌酐浓度，计算尿蛋白/肌酐比值。

1.2.3 血肌酐检测 实验结束后，采用眼球摘除法收集血液，静置4 h，1 500 r/min 离心15 min，取上清，备用。采用肌氨酸氧化酶法检测血肌酐浓度，用酶标仪测定各样本波长546 nm处光密度（OD）值A1和A2，将A1、A2带入公式计算肌酐浓度=［（测定A2-K×测定A1）-（空白A2-K×空白A1）］×标准品浓度/［（标准A2-K×标准A1）-（空白A2-K×空白A1）］，其中稀释因子K=186/246，具体步骤参照说明书进行。

1.2.4 血清IL-35、IL-17检测 采用ELISA方法检测小鼠血清IL-35、IL-17，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.5 流式细胞术检测外周血iTr35细胞比例 采用全血计数法，将小鼠全部处死后取外周血，经体外刺激［丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）20µg/L、离子霉素（Ionomycin）1 mg/L］，2µmol/L莫能菌素（Monensin）作为蛋白转运抑制剂，37 ℃、5%CO2下孵育6 h，以CD4-APC和Foxp3-FITC设门，固定、破膜，经IL-12p35-FITC、IL-27EBI3-PE 抗体染色 30 min，检测 CD4+Foxp3-IL-12p35+IL-27EBI3+（iTr35）细胞比例，染色结束后，上流式分析仪进行流式检测，使用Flow Jo软件进行分析。

1.2.6 肾脏病理染色 小鼠处死后，提取肾组织，固定12 h后，脱水、常规石蜡包埋、切片，厚度为4µm，进行HE、Masson染色，观察肾脏病理改变情况。

1.3 统计学方法 应用SPSS 21.0 统计软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组样本均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠尿蛋白/肌酐值、血肌酐、IL-35、IL-17水平比较 3组小鼠尿蛋白/肌酐值、血肌酐浓度、IL-35及IL-17均有不同程度的改变，其中模型对照组尿蛋白/肌酐值、血肌酐浓度及IL-17含量最高，其次为EsA+IL-12p35抗体组，EsA治疗组小鼠含量最低（P＜0.05）；模型对照组IL-35 含量最低，其次为EsA+IL-12p35 抗体组，EsA 治疗组小鼠 IL-35 含量最高（P＜0.05），见表1。

2.2 各组小鼠外周血iTr35细胞比例比较 与模型对照组（0.064%±0.041%）相比，EsA组（0.398%±0.077%）小鼠外周血iTr35 细胞比例明显升高（P＜0.05）；经IL-12p35抗体干预后，EsA+IL-12p35抗体组iTr35 比例（0.140%±0.027%）较EsA组下降，但仍高于模型对照组（n=8，F=87.695，P＜0.01），见图1。

2.3 各组肾脏病理表现 模型对照组小鼠肾脏病理特点为肾小球系膜细胞及系膜基质增生，毛细血管腔被增生的细胞填满，毛细血管腔闭塞，符合弥漫增生性肾小球肾炎病理改变；此外肾小球周围可见大量炎性细胞浸润，部分可见肾小球硬化及新月体形成。经 EsA 治疗后，EsA组和 EsA+IL-12p35 抗体组系膜增生有所减轻，毛细血管开放增多，炎细胞浸润减少，2组小鼠均未见新月体形成，3组间肾小管无明显变化，见图2。

Tab.1 Comparison of the urine protein/urine creatinine,serum levels of creatinine concentration,IL-35 and IL-17 between the three groups表1 各组MRL/lpr小鼠治疗后尿蛋白/肌酐值、血肌酐浓度、IL-35及IL-17水平比较 （n=8，±s）

Tab.1 Comparison of the urine protein/urine creatinine,serum levels of creatinine concentration,IL-35 and IL-17 between the three groups表1 各组MRL/lpr小鼠治疗后尿蛋白/肌酐值、血肌酐浓度、IL-35及IL-17水平比较 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a与模型对照组比较，b与EsA组比较，P＜0.05

组别模型对照组EsA组EsA+IL-12p35抗体组F尿蛋白/肌酐值（mg/g）18.89±0.93 12.17±1.47a 13.50±0.92ab 78.808＊＊血肌酐（µmol/L）69.81±12.64 22.94±6.25a 36.28±3.48ab 66.287＊＊IL-35（ng/L）116.70±14.03 142.19±6.34a 130.17±12.70ab 9.798＊＊IL-17（ng/L）17.71±1.83 12.76±1.31a 14.64±1.85ab 17.607＊＊

Fig.1 Proportion of iTr35 detected by flow cytometry in three groups图1 流式细胞术检测iTr35在各组中的比例

Fig.2 Pathological changes of renal tissues in three groups of mice(×400)图2 各组小鼠肾组织病变情况（×400）

3 讨论

3.1 EsA 对MRL/lpr 小鼠尿蛋白、血肌酐的影响 SLE 是一种以产生自身抗体为特征，从而导致多器官损害的自身免疫性疾病，肾脏是主要受累器官之一，肾功能恶化是引起病情进展及死亡的重要因素。SLE 患者体内存在T 淋巴细胞功能失调，以致抗原不断出现，并在CD4+T 细胞的刺激下引起B细胞持续活化，产生自身抗体，与抗原结合后形成免疫复合物，通过血液循环沉积于肾脏，导致LN 的发生。因此，调节T细胞亚群的紊乱、减少自身抗体的产生对改善LN患者的预后具有重要意义。MRL/lpr小鼠是自发性系统性红斑狼疮小鼠模型之一，最早8 周发病，16 周出现以严重蛋白尿为特征的肾功能退化，50%小鼠于24 周死亡，其发病无性别优势［12-13］。为此，我们选取 16 周龄的雌性 MRL/lpr 小鼠为研究对象，20 周龄为实验终点符合实验需要。尿蛋白是评估肾脏病变的重要指标，本实验随机尿蛋白/肌酐值是临床上尿蛋白定量检测方法之一，具有快速、简便、精确等优点，能够可靠地反映并替代传统的24 h尿蛋白定量检测。治疗终点对3组小鼠进行尿蛋白/肌酐值、血肌酐浓度检测发现，与模型对照组相比，EsA治疗组小鼠尿蛋白/肌酐值、血肌酐浓度明显下降，经IL-12p35 抗体阻断后，EsA+IL-12p35 抗体组尿蛋白/肌酐值、血肌酐浓度下降程度不及EsA 治疗组，3组尿蛋白/肌酐值及血肌酐浓度水平与既往研究结果相近［14-16］。上述结果说明EsA可减少MRL/lpr 小鼠尿蛋白及血肌酐浓度，改善肾功能，经IL-12p35 抗体阻断后，由于IL-35 合成减少，导致其疗效减弱，使得两指标浓度较EsA组上升，推测EsA 对MRL/lpr 小鼠的治疗疗效可能与IL-35有关。

3.2 EsA对MRL/lpr小鼠外周血IL-35、IL-17、iTr35表达的影响 IL-35是新近发现的抑制性细胞因子，参与多种自身免疫性疾病的发病，在体内外均可抑制炎性细胞因子IL-17的表达。iTr35是IL-35诱导人或小鼠初始T细胞转化而成的一种具有较强免疫抑制功能的、且不依赖FOXP3 的新型FOXP3-Treg，即“iTr35 细胞”，通过分泌IL-35 发挥免疫抑制作用［17］。本研究结果表明，MRL/lpr 小鼠存在 IL-35、IL-17 数量及外周血iTr35 细胞比例的异常，模型对照组小鼠IL-35 表达水平和外周血iTr35 细胞比例最低，而IL-17水平最高，经EsA治疗后，EsA组小鼠的 IL-35 水平及 iTr35 细胞比例明显上升，IL-17 则显著减少，说明EsA可上调IL-35表达，诱导iTr35生成，抑制IL-17的分泌。为了观察EsA对IL-17的抑制是否通过IL-35 调控，笔者用IL-12p35 抗体阻断IL-35 的合成，发现EsA+IL-12p35 抗体组小鼠血清IL-35 表达较EsA组减少，但仍高于模型对照组，此时IL-17水平较EsA组增加，说明EsA对IL-17的抑制作用可通过IL-35来调控。

3.3 EsA 对MRL/lpr 小鼠肾脏病理改善情况 肾脏病理是诊断狼疮性肾炎及分型的“金标准”。本研究发现，3组小鼠肾脏病理表现存在不同程度的改变，其中模型对照组肾脏病变最为严重，主要表现为肾小球系膜细胞增生，经EsA治疗后，其病理表现可得到一定的改善，进一步证实了EsA 对狼疮性肾炎的治疗作用。

综上所述，EsA 可显著改善LN 小鼠模型尿蛋白、血肌酐及肾脏病理情况，其机制可能与上调IL-35表达、诱导iTr35细胞生成有关。但其中的因果关系并不明确，可能存在3种情况：一是EsA直接上调IL-35的表达，IL-35诱导iTr35分泌，从而导致iTr35增多；二是EsA 诱导iTr35 细胞的生成，iTr35 再分泌更多的IL-35发挥作用；三是EsA可对IL-35及iTr35均产生作用，EsA对两者的调控机制如何，还需进一步实验研究证实。但可以肯定的是，EsA可通过IL-35 调控IL-17，进而发挥药理作用，减少IL-17 的分泌，减轻炎症反应，缓解LN的病情。