章喜昌

【摘 要】通过测定氰戊菊酯在不灭菌土壤和灭菌土壤中碳同位素比值变化明确微生物降解氰戊菊酯过程会产生显著的稳定碳同位素分馏效应，从而说明稳定同位素技术可以应用于氰戊菊酯微生物降解的定性评估。

【关键词】碳同位素;氰戊菊酯;同位素分馏

中图分类号： X172 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）08-0187-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.08.081

【Abstract】By measuring the carbon isotope ratios of fen valerate in sterilized and non-sterilized soils， it is clear that the process of microbial degradation of fen valerate will produce significant stable carbon isotope fractionation effect， which indicates that stable isotope technology can be applied to qualitative assessment of microbial degradation of fen valerate.

【Key words】Carbon isotope; Fen valerate; Isotope fractionation

稳定性同位素技术从20世纪60年代开始定型并逐步发展起来的一门分支学科，在矿床学、医学、生物工程、食品 工程等研究领域广为应用，[1-2]由于其分析结果精确可靠、故已被广泛应用于环境污染物的来源分析与示踪研究。

在研究环境中有机污染物降解过程的疑惑之一在于它们可以通过多种过程被降解，比如有氧和厌氧降解，生物和非生物转化等。而通过稳定性同位素分析技术，我们很方便的确认污染物降解的主导过程及其同位素富集因子，并识别其反应机理。有机污染物的降解途径受环境条件（如氧气含量，酸碱度）的影响，并产生同位素分馏差异。Rosell等）研究了甲基叔丁基醚（MTBE）在有氧降解（C-H键氧化）、厌氧降解（SN2反应）和酸性水解（SN1反应）时的C和H同位素分馏，Elsner[8]对这些不同降解途径的δ13C和δD值分别进行了线性回归分析，发现δ13C和δD呈现出较好的线性相关关系。因此，我们可以用稳定同位素分析技术研究污染物的降解途径，从而揭示其降解机理。

定量评估农药的微生物降解一直环境研究热点之一，传统方法在评估环境中农药的微生物降解时，是通过测定一些微生物活性指标来定性和定量的，如底物和电子受体浓度的降低，微生物量和降解产物的增长等，但这些基于浓度的指标并不能真实反映农药的微生物降解。一些自然过程，如挥发、稀释和吸附等，也会引起农药浓度的变化，而农药本身并没有发生降解。此外，在復杂的自然环境体系中很难准确获得底物、电子受体和降解物的物料平衡。有研究表明，在微生物降解过程中，包含轻同位素（如12C）的键反应速率相较于重同位素更快，引起重同位素（如13C）在残留的农药中富集。因此，我们可以利用稳定同位素分析技术研究同位素组成与生物降解率的关系，从而对农药的微生物降解进行定性分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与耗材

IsoPrime 100 同位素比质谱仪，配备Agilent 7890A 气相色谱仪和GC-V燃烧转化炉，购自英国GV公司;XPE26C 微量分析天平，购自瑞士MettlerToledo 公司;氦气（纯度>99.999%）、氧气（纯度≥99.9992%）、二氧化碳（参考气，纯度≥99.9995%），均购自上海比欧西气体工业有限公司;

IAEA600 咖啡因（δ13C=-27.771‰），购自国际原子能机构，作为参考气校准物质和质量控制标准物;氰戊菊酯（fen valerate）固体标样，纯度为99.7%

1.2 样品处理

土壤样品采自农田表层土（0～10cm深），在阴暗干燥，压碎土块，剔除石块、动植物残体等杂物后，再铺成薄层，使其自然风干，过2mm的筛用于实验。

取20个50mL锥形瓶（带橡胶塞），用分析电子天平称取5.0000±0.0250g土壤样品分别加入锥形瓶中并使其在瓶底摊平，用1mL移液枪在每个锥形瓶中均匀喷洒3mL的自来水，塞上橡胶塞后称量记录下每个锥形瓶的总质量。将锥形瓶放入恒温摇床，以30℃，120r/min振荡30min，然后放入恒温培养箱，在30℃下避光培养2周。

从恒温培养箱取出锥形瓶，均分为A、B两组，将A组置于高压灭菌锅，在121℃下灭菌3次，每次20 min。然后再将A、B两组分别均分为A1、A2组和B1、B2组，用1mL移液枪在A1和B1每个瓶中均匀喷洒1mL浓度为10mg/L的氰戊菊酯标准溶液，在A2和B2中均匀喷洒1.5mL浓度为50mg/L的氰戊菊酯标准溶液。

将锥形瓶置于恒温摇床以30℃，120r/min振荡10min，使氰戊菊酯均匀分布于土壤样品中，待正己烷挥发殆尽后塞紧瓶塞，通过称重在A、B组中分别补加灭菌的和不灭菌的自来水后再塞紧瓶塞。再放入恒温培养箱，在30℃下避光培养。

每隔15天从培养箱中取出A1、A2、B1和B2各三个样品用于分析其中氰戊菊酯的碳同位素组成（δt13C）：选用索氏提取法提取土壤中的氰戊菊酯：连接好索氏提取装置，用正己烷索提洗涤玻璃纤维滤筒和棉花8小时后，将正己烷换成160 mL的索氏提取液（正己烷：丙酮/v：v=7：1），在锥形瓶中加入适量无水硫酸钠，与土壤样品搅拌均匀后全部转移至玻璃纤维滤筒中，连接好索氏提取装置，索氏提取24小时后将索提管及滤筒中的提取液一并转入平底烧瓶中。在45℃水浴温度，75r/min转速和450hPa初始压力下用旋转蒸发仪对提取液进行浓缩，随着提取液的不断减少，逐步降低压力，最后在360hPa压力下浓缩至1～2mL。

用正己烷湿法装柱，在玻璃层析柱中装好填料，从下到上依次为5g无水硫酸钠、5g弗罗里硅土、3.5g硅胶和5g无水硫酸钠。然后将浓缩后的提取液转移到层析柱，用100 mL的洗脱液（正己烷：丙酮/ v：v=9：1）进行洗脱，并收集于平底烧瓶。在45℃水浴温度，75r/min转速和400hPa初始压力下用旋转蒸发仪对柱后洗脱液进行浓缩，随着洗脱液的不断减少，逐步降低压力，最后在360hPa压力下浓缩至1～2mL。

将浓缩后的柱后洗脱液氮吹至近干，用100μL正壬烷溶解转移至150μL玻璃内衬管进GC-C-IRMS分析氰戊菊酯的同位素组成（δt13C）。

1.3 数据处理

其中，R（13C/12C）sample是有机化合物样品中的碳同位素比值，R（13C/12C）standard是国际标准物质中的碳同位素比值，碳同位素的国际标准物质是美国南卡罗来纳州白垩系皮狄组的美洲拟箭石（PDB），相对差值δ一律用千分数表示，样品结果允许标准偏差为<0.3‰。如果测得的δ值是正的，表示样品相比于标准13C富集，反之，则表示样品相比于标准13C贫化。

2 结果与讨论

随着培养时间的推移，氰戊菊酯的δ13C值的测定结果如图1所示。经过60天的培养，在非灭菌组中观测到了显著的稳定碳同位素分馏，加标浓度为2mg/kg的土壤中氰戊菊酯的δ13C值从-28.62±0.31‰上升到-25.54±0.19‰，而加标浓度为15mg/kg的土壤中氰戊菊酯的δ13C值從-28.62±0.31‰上升到-26.78±0.28‰。以此同时，灭菌土壤中氰戊菊酯的δ13C值只发生了非常不显著的变化。实验结果表明，主要引起氰戊菊酯降解过程中碳稳定同位素分馏的是微生物降解，而不是非生物降解。

众所周知，在代谢特定某些有机质过程中，微生物倾向于利用分子中的较轻同位素（例如12C），从而导致剩余有机质中含重同位素（例如13C）的增加，从而导致同位素分馏现象的发生。尽管如此，在某些特定的环境中，微生物降解与稳定同位素分馏并不完全存在着因果关系。实验中发现残留氰戊菊酯的δ13C值的明显增加说明了氰戊菊酯的微生物降解能引起稳定碳同位素分馏现象，这表明应用稳定碳同位素分析技术来指示氰戊菊酯的衰减过程中存在微生物降解并进一步评估其生物降解率成为了可能。

3 结论

通过碳稳定同位素质谱技术，我们比较了氰戊菊酯在不灭菌土壤和灭菌土壤中碳同位素比值随着培养时间的变化情况。实验结果表明：氰戊菊酯在土壤中的非生物降解过程对稳定碳同位素比值δ13C的变化没有产生明显作用，而微生物降解过程引起了显著的稳定碳同位素分馏，因此，稳定同位素分析技术可以应用于氰戊菊酯衰减过程中微生物降解的定性评估。

【参考文献】

[1]林光辉.稳定同位素生态学.北京：高等教育出版社，2013：5.

[2]白志鹏，张利文，彭林，等.稳定性同位素在污染物溯源与 示踪中的应用[J].城市环境与城市生态，2006，19（4）：29-32.