缪炜伦 陈明龙 施姣姣

目前对心房颤动(简称房颤)机制的研究多采用快速电刺激诱发动物自发性房颤[1]或者是电刺激模式细胞如小鼠心房肌细胞(HL-1)细胞模型[2]，但是此方法需要耗费较多的人力物力，并且存在种属差异，不是后续进行药物筛查最优选择。

人源诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSC)技术发展至今，具有分化成心肌细胞、神经细胞、肝脏细胞等多向分化潜能，已经成为基础研究领域的重要工具[3]。其中心肌细胞已经从非定向分化发展成可定向分化为心房肌、心室肌以及窦房结细胞[4]。笔者以利用hiPSC特异性分化为心房肌细胞构建高频电刺激心房细胞损伤模型，并探讨其分子机制。

1 材料与方法

1.1 干细胞培养以及心房肌分化

将hiPSC株(NC5)(笔者实验室自主构建)种于六孔细胞培养皿上，培养皿预先用基质胶Matrigel(Corning公司)铺板。干细胞培养使用mTeSR培养基(Stemcell Technologies公司)，待细胞长到铺满90%以上的密度即可开始分化。培养基更换成含2% B-27 minus insulin(Gibco公司)的RPMI 1640培养液(Gibco公司)。分化方法分为两组，心房肌组和传统组。分化前4天方法相同。第0～1天，外加GSK-3抑制剂CHIR-99021(6μmol/L，Selleckchem公司)处理。第3～4天，外加Wnt通路抑制剂IWR-1(5 μmol/L，Sigma-Aldrich公司)处理。第5～7天心房肌组外加视黄酸(Retinoic Acid，RA, 2μmol/L，Sigma-Aldrich公司)处理而传统组不添加。细胞分化的第8天更换成含有2% B-27supplement(Gibco公司)的RPMI1640溶液。细胞分化的第12～14天左右，细胞开始跳动，利用纯化液(无糖DMEM,Gibco公司)纯化48 h以除去非心肌细胞，继续培养至30天，细胞相对成熟，可用于实验研究。

1.2 建立高频电刺激心房肌损伤模型

用0.25%含EDTA的胰酶(Gibco公司)将分化第30天的心房肌肌细胞从分化培养皿中消化下来，种于六孔板中。待至少48 h细胞稳定贴壁，并且再次出现跳动后，可进行电刺激实验。将经过无菌处理的电刺激电板(C-Pace100TMculture dishes，IonOptix公司)置于六孔板中与细胞培养液直接接触，外接导电线于电刺激仪(C-Pace100TMculture Pacer，IonOptix公司)。分组：高频组(RAP组)、对照组(Control组)。电刺激参数：电压3 V，频率7 Hz，刺激时间24 h。另外采用500 nmol/L 4-苯丁酸钠(4PBA)预处理接受高频电刺激的心房肌细胞，具体方法为将4-苯丁酸钠4PBA加入培养液后进行电刺激处理，后续实验前进行洗脱。

1.3 分子学实验

1.3.1免疫荧光染色 将含有分化心房肌的爬片先用4%多聚甲醛室温固定20 min，用PBS冲洗后Triton-X 100通透5 min。再用5%牛血清白蛋白封闭30 min。封闭结束后敷一抗，并在4°C中过夜(至少16 h)。主要的一抗包括：鼠抗α-actinnin(1∶100，Abcam公司)以及兔抗NR2F2(1∶200，Abcam公司)。一抗孵育过夜后室温孵育二抗山羊抗兔IgG(Alexa Fluor®488, 1∶500, Abcam公司)以及驴抗IgG(AlexaFluor®488, 1∶500, Abcam公司)至少1 h后，PBS冲洗。最后用核染色剂DAPI(Life Technologies公司)染色封片。

1.3.2单细胞钙瞬变检测 应用Fluo-3 AM(Life Technologies公司)检测细胞内钙瞬变。根据产品说明，5 mol/L Fluo-3溶于DMSO中，混合20%(w/v)F-127(Sigma公司),同时加入到细胞培养基中，稀释到工作浓度5 μmol/L。将细胞培养液替换成还有Fluo-3的溶液，并在37℃培养箱中孵育90 min后替换为正常培养基继续孵育30 min，最后替换成台式液后在荧光显微镜下观察。心肌细胞中的Fluo-3能够被波长为488 nm的光激发，同时放出波长为520 nm的发射光，该发射光能被E3CMOS相机(Touptek公司)记录。钙瞬变通过ΔF/F0来计算，ΔF指代荧光强度相比于最小荧光强度F0的变化值。

1.3.3细胞凋亡流式检测 高频电刺激后，用无EDTA的胰酶消化心肌细胞，每个样品管至少收集106个细胞，并用预冷的PBS冲洗两次，离心吸干上清之后用每管300 μl缓冲液重悬细胞。同时加入annexin V/PI(BD Pharmingen公司)，室温避光孵育20 min。样品在1 h内通过流式检测仪(BD FACSCalibur)检测。

1.3.4实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR) 利用TRIzol(Invitrogen公司)提取细胞RNA。通过逆转录试剂盒SuperScript Reverse Transcriptase(Bio-Rad公司)将RNA逆转录成cDNA。引物序列由ThermoFisher公司设计合成，见表1。利用SYBR Green(Bio-Rad公司)进行荧光定量，并在AB 7900HT Real-Time PCR System (ABI公司，美国)上进行检测。内参采用GAPDH。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.5统计学分析 所有的数据均用Graphpad Prism5软件进行分析。所有数据以均值±标准差表示。两组分化方法以及电刺激前后比较采用配对样本t检验进行分析，以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 人源诱导干细胞分化特异性心房肌细胞(iPSC-atrial CM)

心房肌组一般在第14天左右细胞会开始跳动，而传统组一般稍早一些，在12天左右开始跳动。当分化达到30天时，认为心肌细胞相对成熟。两组分化细胞均表达心肌细胞肌节结构α-actinnin，心房肌组表达心房肌细胞特有的核蛋白NR2F2，但传统组几乎不表达。见图1。同时qRT-PCR结果显示，心房肌组NR2F2表达量也明显高于传统分化组[4.763±0.244 7(n=6) vs 1.032±0.146 7(n=6),P<0.05]。

2.2 钙稳态比较

RAP组心房肌细胞的钙瞬变峰值ΔF/F0相比Control组明显下降[0.783 3±0.104 7(n=10) vs 2.401 0±0.161 8(n=15),P<0.05]，见图2，RAP组相比于Control组RYR2基因的表达量也明显下降[0.563 6±0.076 1(n=6) vs 1.009±0.091 4(n=6),P<0.05]。为了检测4PBA对钙稳态的调节作用，增设一组(4PBA+RAP组)进行三组比较，见图3。4PBA+RAP组的钙瞬变峰值ΔF/F0相比于RAP组明显增加[2.274 0±0.169 7(n=17) vs 1.276 0±0.135 6(n=10)，P<0.05]，但与对照组无差异[2.679 0±0.123 9(n=10),P>0.05]。见图3。

图1 心房肌组以及传统组心肌细胞免疫荧光染色

图2 两组钙瞬变(ΔF/F0)比较

图3 4-PBA预处理后钙瞬变ΔF/F0比较

2.3 两组细胞凋亡比较

RAP组细胞的早期凋亡(AV+/PI-)以及晚期凋亡(AV-/PI+)比率之和明显高于Control组[55.27%±2.24% vs 19.41%±0.84%，P<0.005]，见图4。同时RAP组相比于Control组促进凋亡指标bax表达上升[1.309±0.022(n=6) vs 1.003±0.050(n=6)，P<0.05]；抑制凋亡指标bcl-2表达下降[0.383±0.011(n=6) vs 1.005±0.068(n=6),P<0.05]。

图4 两组细胞早期凋亡以及晚期凋亡比例之和

3 讨论

人源诱导分化多能干细胞技术发展以来，被广泛应用于建立疾病模型、药物筛查应用以及细胞治疗等方面,该技术的优势在于利用iPSC可以分化成特异性的目的细胞[5]。本研究旨在于将干细胞定向分化为心房肌细胞，取代HL-1，打破传统机制研究以及药物筛查的种属差异，并能够为后期大范围药物筛查以及毒理研究提供物质基础。利用笔者实验室已建立的正常人iPSC细胞系(NC5)为基础[6]，通过RA诱导分化技术[7-9]将干细胞定向分化为心房肌细胞。分化达到30天的心房肌细胞经染色显示表达心房肌特异性核蛋白(NR2F2)，并且基因表达量也明显高于传统分化方法分化所得细胞，证实该技术确实可以提高心房肌的分化效率。

先前的研究通过高频刺激兔心房诱发房颤发现心房肌细胞出现明显的钙稳态异常[10]。在笔者的研究中首次电刺激人源诱导干细胞分化特异性心房肌细胞，从人源角度细胞水平探讨心房肌在接受高频电刺激后的损伤变化。结果显示，iPSC-atrial CM在接受了高频电刺激后出现了相同的钙稳态异常表现。同时，有研究表明房颤发生后钙稳态改变与细胞钙离子通道活动异常有关[11]，所以笔者检测细胞钙交换相关离子通道RYR2的表达量，它是内质网上参与钙触发-钙释放的离子通道，与细胞内钙超载密切相关，结果显示RYR2在mRNA水平表达下降。mRNA水平改变与蛋白质水平改变并不是一定是平行关系，但是先前的研究表明RYR2蛋白水平下降，同时伴随着钙电流的减小[6]。由于细胞内钙超载也是导致内质网应激以及细胞凋亡很重要的原因，所以笔者检测高频电刺激对于心房肌细胞凋亡的影响，结果显示高频电刺激会引起心房肌细胞凋亡增加。以上结果表明，iPSC-atrial CM接受高频电刺激后出现的损伤改变与动物模型中房颤发生后的钙稳态异常有着共同处，因此可以从该角度模拟房颤损伤机制。为了检测高频电刺激对于心房肌细胞的钙稳态损伤是否具有保护作用，笔者利用一种新型化学分子伴侣4PBA处理接受高频电刺激的心房肌细胞。有研究表明，4PBA能够有效抑制内质网应激，改善非折叠蛋白功能，减轻肌细胞的损伤[12]。所以笔者用4-PBA处理接受高频电刺激的心房肌细胞，结果表明，经过4PBA处理的心房肌细胞钙稳态异常明显减轻，这可能与4PBA改善内质网应激有关。4PBA可以作为一种潜在的保护心房肌细胞免于高频电损伤的治疗方法。