刘 正，王 静，沈 伟，赵舒煊，袁文华，周海宇

1.兰州大学第二医院骨科，甘肃 兰州 730030；

2.甘肃省骨关节疾病研究重点实验室，甘肃 兰州 730030；

3.解放军第九四三医院特诊科，甘肃 武威 733000

骨肉瘤是骨骼中常见的恶性肿瘤之一，主要见于儿童和青少年，并且与高度恶性、早期转移、快速进展及不良预后相关。骨肉瘤表现出高度恶性并且倾向于早期转移：在新诊断的患者中经常观察到肺转移，并且在没有化疗的情况下肺部症状可能在1年内发展［1］。对于患有骨肉瘤的患者，目前大多数治疗方案通常涉及强化新辅助化疗，然后进行手术切除。仅接受手术治疗的高级别骨肉瘤患者的预后非常差，5年生存率低于20%［2］。骨肉瘤患者死亡的主要原因是肺转移，预后差［3-5］。尽管临床研究已经取得了较大的进步，但是其转移及复发率仍然很高。EphA7是酪氨酸蛋白激酶受体家族中的重要成员之一，在多种组织或细胞中广泛表达，对调节细胞生长、迁移及血管形成具有潜在的作用。近年来研究发现，EphA7蛋白在一些恶性肿瘤中呈高表达和高活性，其在肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程中发挥重要作用［6-7］。本研究旨在观察EphA7在骨肉瘤中的表达情况，了解EphA7对人骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 患者组织标本

收集兰州大学第二医院2010年1月—2017年12月经手术切除的骨肉瘤标本45例，术前均未行放化疗，所有标本均经病理学检查证实。另取对应45例瘤旁正常组织作为对照。将组织标本立即在液氮中冷冻以供进一步使用。本研究经兰州大学第二医院伦理委员会批准。所有患者均签署知情同意书。

1.2 细胞培养

人骨肉瘤MG-63细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。将人骨肉瘤MG-63细胞在含有10%胎牛血清（购自美国Hyclone公司）的MEM培养基（购自美国Hyclone公司）中培养，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中。当细胞密度为90%时，弃去先前的培养基，随后使用PBS对细胞进行2次漂洗，然后用0.25%胰蛋白酶（购自美国Gibco公司）消化，将细胞在含有10%胎牛血清的MEM培养基中制成单细胞悬浮液，并以规则的间隔传代。选择对数生长期的细胞用于进一步的实验。

1.3 细胞转染

计数对数生长期的细胞并接种到6孔板（每孔2×105个细胞）上，直到细胞汇合至60%～80%。根据制造商的说明，使用siRNA Reagent System试剂盒（购自美国Santa公司）转染细胞。将6 μL EphA7-siRNA或阴性对照siRNA（购自美国Santa公司）转染到MG-63细胞中。转染后，将细胞在37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养5～7 h。然后将细胞在含有10%胎牛血清的MEM培养基中再培养24～48 h，用于以下实验。将细胞分为siRNA-EphA7组（EphA7-siRNA转染）、siRNA-Control组（阴性对照siRNA转染）和空白组（未转染）。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）检测

使用TRIzol试剂（购自北京索莱宝科技有限公司），根据制造商的方案从组织或MG-63细胞中提取总RNA。使用紫外分光光度计测量260 nm/280 nm处的吸光度（D）值来检测RNA的浓度和纯度。D260nm/D280nm在1.7和2.1之间表明RNA具有高纯度，可用于后续实验。使用PCR系统（购自瑞士Roche公司）反转录合成cDNA模板，LightCycler 96 RTFQPCR系统进行RTFQ-PCR实验。反应系统包括TB Green Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL、PCR正向引物（10 μmol/L）0.8 μL、PCR反向引物（10 μmol/L）0.8 μL、cDNA模板2.0 μL和灭菌蒸馏水6.4 μL。GAPDH作为内部对照。EphA7的正义链为5’-CCTGAGGGATTGTAAC AGTCTT-3’，反义链为5’-GGTCACCTTG GGTAAAACTTTC-3’；GAPDH的正义链为5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3’，反义链为5’-TCCACCACCCAGTTGCTGTA-3’。

1.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测

使用蛋白质裂解缓冲液（购自上海碧云天生物技术有限公司），根据相关步骤从组织或MG-63细胞中提取总蛋白质。用BCA试剂盒（购自上海碧云天生物技术有限公司）测定总蛋白质浓度。通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离总蛋白质，然后将蛋白质转移到PVDF膜（购自广州赛国生物科技有限公司），并用5%脱脂牛奶封闭2 h，然后在4 ℃下将其与一抗（EphA7，1∶1 000稀释；β-action，1∶500稀释）（购自美国Santa公司）温育过夜。将膜洗3次，每次15 min，然后与二抗（羊抗鼠IgG，1∶8 000稀释）（购自美国Santa公司）一起温育2 h。采用电化学发光ECL（购自美国Advansta公司）检测Western blot条带。使用Image J软件以β-actin作为内部参照分析靶蛋白的相对水平。

1.6 细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）测定

当细胞密度达到80%时，用PBS洗涤细胞2次，然后用0.25%胰蛋白酶消化以制备单细胞悬浮液。计数后，将细胞接种到96孔板（每孔3×103～6×103个细胞，200 μL）上，5个重复孔。将细胞分别培养24、48和72 h后，从培养箱中取出，每孔加入10 μL CCK-8（购自日本Dojindo公司）。然后，将细胞再培养4 h。使用酶标仪（购自美国Awareness公司）在450 nm处检测每个孔的D值。在横坐标上绘制细胞生存曲线，在纵坐标上绘制D值。

1.7 划痕实验

转染48 h后，将人骨肉瘤MG-63细胞接种到6孔板上，每孔1×105个细胞。当细胞汇合度达到90%～100%时，使用200 μL移液管尖端在6孔底部进行5次垂直划痕。将6孔板用PBS洗涤2次以洗去漂浮的细胞，然后更换新鲜无血清培养基，在37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下进行培养。0和24 h时在倒置显微镜下分别拍照，观察并测量划痕的宽度。使用Image J软件计算细胞间距离的均值。划痕的愈合率=［（0 h的划痕宽度－24 h的划痕宽度）/0 h的划痕宽度］×100%。

1.8 Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染色法流式细胞术检测

转染48 h后，用胰蛋白酶消化细胞，并收集到试管中。以1 000 r/min离心5 min后弃去上清液。用4 ℃的PBS清洗细胞3次，然后以1 000 r/min离心5 min后弃去上清液。根据Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）的说明，向每个管中加入150 μL结合缓冲液和5 μL Annexin V-FITC。在室温下避光温育15 min后，向管中补充结合缓冲液100 μL和PI 5 μL。采用流式细胞术检测细胞凋亡。

1.9 统计学处理

采用SPSS 23.0统计软件处理数据，结果以x±s表示，组间比较应用t检验和方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 骨肉瘤组织及瘤旁正常组织中EphA7的mRNA表达

采用RTFQ-PCR检测EphA7的mRNA在骨肉瘤及癌旁正常组织中的表达。结果显示，与瘤旁正常组织相比，骨肉瘤组织中EphA7的mRNA的表达量显著增加（P＜0.05，图1）。

图 1 骨肉瘤组织与癌旁正常组织中EphA7的mRNA表达Fig. 1 mRNA expressions of EphA7 in osteosarcoma and adjacent normal tissues

2.2 骨肉瘤组织及癌旁正常组织中EphA7的蛋白表达

采用Western blot检测在骨肉瘤及瘤旁正常组织中EphA7的蛋白表达。结果显示，与瘤旁正常组织相比，骨肉瘤组织中EphA7的蛋白水平显著增加（P＜0.05，图2）。

图 2 骨肉瘤组织及癌旁正常组织中EphA7的蛋白水平Fig. 2 Protein level of EphA7 in osteosarcoma and adjacent normal tissues

2.3 人骨肉瘤MG-63细胞中EphA7的mRNA表达

采用RTFQ-PCR检测人骨肉瘤MG-63细胞中EphA7的mRNA表达。结果显示，siRNA-EphA7组与空白组和siRNA-Control组相比，MG-63细胞中mRNA的表达显著降低（P＜0.05），空白组与siRNAControl组之间差异无统计学意义（P＞0.05，图3）。

图 3 RTFQ-PCR检测3组MG-63细胞中EphA7的mRNA表达Fig. 3 Detection of EphA7 mRNA expression in three groups of MG-63 cells by RTFQ-PCR

2.4 人骨肉瘤MG-63细胞中EphA7的蛋白表达

采用Western blot检测MG-63细胞中EphA7的蛋白水平。结果显示，siRNA-EphA7组与空白组和siRNA-Control组相比，MG-63细胞中的蛋白水平显著降低（P＜0.05），空白组与siRNA-Control组之间差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。

图 4 Western blot检测3组MG-63细胞中EphA7的蛋白水平Fig. 4 Western blot analysis of EphA7 protein level in three groups of MG-63 cells

2.5 EphA7对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响

在敲低EphA7的表达后，使用CCK-8测定以检测MG-63细胞的增殖。构建24、48和72 h的增殖曲线。结果显示，siRNA-EphA7组中MG-63细胞增殖明显减慢，与空白组和siRNA-Control组相比，siRNA-EphA7组在48和72 h时D值显著降低（P＜0.05），在24 h差异无统计学意义（P＞0.05，图5）。当EphA7表达受到抑制时，MG-63细胞的增殖被显著抑制（P＜0.05）。空白组与siRNA-Control组细胞增殖差异无统计学意义（P＞0.05）。

图 5 CCK-8检测3组MG-63细胞的生长情况Fig. 5 The growth of three groups of MG-63 cells detected by CCK-8

2.6 EphA7对人骨肉瘤MG-63细胞迁移的影响

培养24 h后，空白组和siRNA-Control组中MG-63细胞划痕愈合率分别为（68.41±3.27）%和（66.74±2.63）%（P＞0.05），siRNA-EphA7组MG-63细胞的划痕愈合率为（47.53±3.18）%，显著低于空白组和siRNA-Control组（P＜0.05，图6）。结果表明，EphA7表达的下调抑制了MG-63细胞的迁移。

2.7 EphA7对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响

采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测敲低EphA7表达后MG-63细胞数的凋亡。空白组、siRNA-Control组和siRNA-EphA7组的凋亡率分别为（17.62±1.25）%、（18.23±1.27）%和（29.59±1.64）%。与空白组和siRNA-Control组相比，siRNA-EphA7组MG-63细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）。空白组和siRNA-Control组的细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05，图7）。说明EphA7表达的下调显著促进MG-63细胞的凋亡。

3 讨 论

EphA7作为Eph家族的重要一员，定位于染色体6q-16.1上，最早是由Ciossek等于1995年在鼠类的神经系统中发现的，他们还发现了若干个剪接变异体。随后，研究者们在人类胎儿脑组织的cDNA文库中也分离出EphA7受体［8］，另有研究者发现其广泛分布于人体组织中［9］。

以往对EphA7的研究多集中在生物体正常生理过程中的信号传递，以及胚胎和神经系统的发育等生理问题，其在血管的形成、肿瘤的发生及肿瘤血管形成中的研究相对较少。近年来，有研究者在多种肿瘤模型的研究中发现，EphA7与多种恶性肿瘤的发生、发展有着密切的关系。关于EphA7在肿瘤中的作用，目前也得出了一些相互矛盾的结论。有研究认为EphA7是肿瘤抑制因子：Oricchio等［10］研究发现，EphA7在72%的滤泡性淋巴瘤中失活，敲除EphA7可以驱动小鼠滤泡性淋巴瘤模型中的淋巴瘤发展；Wang等［11］研究发现，EphA7在结肠癌和多种结肠癌细胞系中低表达，过表达后可促进结肠癌细胞发生凋亡；此外，Li等［12］也发现，在前列腺癌组织和前列腺癌细胞系中EphA7低表达，调高EphA7表达后，可延迟前列腺癌细胞增殖，并可抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭。在另一些研究中则得出相反的结论：Wang等［13］描述了EphA7在胃癌样本中的差异表达及EphA7表达与临床病理学特征之间的相关性，对52例胃癌标本中的EphA7进行免疫组织化学染色，发现该蛋白水平与其转录水平一致，该蛋白在年轻患者和晚期肿瘤患者中显著升高；Xiang等［14］发现，在喉癌细胞系中EphA7表达增高，下调EphA7基因的表达可以抑制肿瘤细胞的生长，EphA7基因表达下降则促进细胞凋亡；最近有研究表明［15］，与健康的肝脏组织相比，EphA7的mRNA在肝细胞癌中显著上调，并且EphA7在肺癌中也被转录激活。

在骨肉瘤中EphA7的作用是否与上述表现一致，通过本实验得到了验证。本研究发现，EphA7在骨肉瘤组织中的表达上调，在体外研究中，EphA7-siRNA可显著敲低人骨肉瘤MG-63细胞中EphA7的表达，在MG-63细胞中敲低EphA7可抑制MG-63细胞的增殖、迁移，促进其凋亡。因此，EphA7在调节骨肉瘤细胞生长、迁移和凋亡中具有关键作用，其可能作为人骨肉瘤治疗中的潜在治疗靶标或预测指标。EphA7有可能是骨肉瘤的一个新的标志物，对其结构和功能的深入研究有望为防治骨肉瘤提供新思路。但是要将这些指标应用于临床，还需要大量的样本进行深入研究，必须结合其他因素进行多指标、多因素综合分析，EphA7在骨肉瘤中的作用方式及其机制也需要深入研究。