呋吡菌胺原药高效液相色谱内标分析方法研究
2019-04-26许艳秋王广成陈丙坤高立明吴春先
李 婷，许艳秋,王广成，陈丙坤，高立明，吴春先
(四川省农药检定所，四川 成都 610041)
呋吡菌胺(Furametpyr)CAS号为123572-88-3，分子式：C17H20ClN3O2，化学名称：(RS)-5-氯-N-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基异苯并呋喃-4-基)-1,3-二甲基吡唑-4-甲酰胺，是由日本住友化学株式会社开发的琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂。呋吡菌胺具有内吸活性，且传导性能优良，对担子菌纲的大多数病菌具有活性，尤其是对丝核菌属和伏革菌属引起的植物病害，如水稻纹枯病、菌核病、白绢病等有特效[1]。
呋吡菌胺纯品为无色或浅棕色固体，可溶于丙酮等有机溶剂，其结构式如下：
目前国内对呋吡菌胺的分析尚未见报道。本文首次采用高效液相色谱内标法对呋吡菌胺进行定性和定量分析。该方法操作简便、准确，分离效果好，准确度和精密度均能达到定量分析的要求。
1 试验部分
1.1 试剂与仪器 Waters 2695高效液相色谱仪，带2996二极管阵列检测器和Empower工作站；色谱柱：C18250mm×4.6mm；乙腈，HPLC级；乙酸，分析纯；联苯，分析纯；呋吡菌胺标准品，质量分数99%(购于Dikma公司)；97%呋吡菌胺原药(购于上海安谱实验科技股份有限公司)。
1.2 色谱操作条件 流动相：乙腈+0.3%乙酸溶液=70+30(v/v)；流量：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：228nm；进样体积：5μL；保留时间：呋吡菌胺约4.6min，内标联苯约7.5min。
典型的标样及呋吡菌胺原药高效液相色谱图(图1、图2)。
图1 呋吡菌胺标样和联苯液相色谱图
图2 97%呋吡菌胺原药和联苯液相色谱图
1.3 测定步骤
1.3.1 内标溶液的配制 称取约0.5g(精确至0.000 2g)联苯于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，摇匀作为内标溶液备用。
1.3.2 标样溶液的配制 称取呋吡菌胺标样约0.05g(精确至0.000 2g)于50mL容量瓶中，用移液管准确加入5.0mL内标溶液，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，超声波5min，静置至室温，备用。
1.3.3 试样溶液的配制 称取97%呋吡菌胺原药约0.06g(精确至0.000 2g)于50mL容量瓶中，用1.3.2中同一移液管准确加入5.0mL内标溶液，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，超声波5min，静置至室温，备用。
1.3.3 测定 在上述色谱条件下，待仪器基线稳定，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针呋吡菌胺的响应值相对变化<1.5%，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。
1.3.4 计算 将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液呋吡菌胺峰面积和内标物峰面积的比值分别进行平均，试样中呋吡菌胺的质量分数X(%)按下式计算：
式中：A1标样溶液中，呋吡菌胺峰面积与内标峰面积比值的平均值；
A2试样溶液中，呋吡菌胺峰面积与内标峰面积比值的平均值；
m1呋吡菌胺标样的质量，g；
m2呋吡菌胺试样的质量，g；
P标样中呋吡菌胺的质量分数，%。
2 结果与讨论
2.1 流动相的选择 分别用不同比例的甲醇+水、乙腈+水、甲醇+0.3%乙酸水溶液、乙腈+0.3%乙酸水溶液作为流动相，对试样进行分离检测。试验结果表明，当乙腈+0.3%乙酸水溶液作流动相时，呋吡菌胺和联苯能达到有效分离，分离效果好，峰形对称，保留时间适宜。因此选择乙腈+0.3%乙酸水溶液作为样品分离流动相条件。
2.2 内标溶液的选择 通过对呋吡菌胺在上述色谱条件下不断优化，对联苯、对氯苯酚、磷酸三苯酯、邻苯二甲酸丁酯等在相同色谱条件下的出峰情况以及吸收波长相比较，得到联苯作为内标最为合适。
2.3 吸收波长的选择 通过Waters 2996二极管阵列检测器的光谱数据采集功能，获得呋吡菌胺和内标物联苯在190～400nm的吸收波长扫描图(图3)，呋吡菌胺在203、270nm有较好的吸收；联苯在203、248nm有较强的吸收。两者紫外吸收曲线在203、228、270nm处有交叉点，在波长203nm处有最大吸收，但受杂质影响较大；波长270nm处两者的紫外吸收偏小；在波长228nm有较大吸收，且基线平稳，杂质吸收较小，主峰和杂质峰分离效果较好，峰高适中，故确定228nm为本分析方法的检测波长。
图3 呋吡菌胺与联苯紫外吸收全扫描图
2.4 分析方法的线性相关性 分别称取呋吡菌胺标准品(0.026 4、0.040 9、0.053 6、0.064 7、0.100 8g)于50mL容量瓶中，准确加入联苯内标溶液(28.02mg/5mL)5.0mL，用乙腈定容，配制成5个不同浓度的标样溶液。在上述色谱操作条件下进行分析，以标准品溶液与内标物联苯的质量比为横坐标，呋吡菌胺与内标物联苯的峰面积之比为纵坐标绘制标准曲线，得到呋吡菌胺的线性方程为y=0.507 7x+0.074 5，R2=0.999 4。
2.5 分析方法的精密度 从同一个97%呋吡菌胺中准确称取5个试样，在上述色谱操作条件下进行分析，测得呋吡菌胺含量为97.35%，标准偏差为0.12，变异系数为0.12%(表1)。
表1 分析方法的精密度试验结果
2.6 分析方法的准确度 以已知含量为97%的呋吡菌胺原药样品为本底，分别加入一定量的呋吡菌胺标准品于50mL的容量瓶中，准确加入5.0mL内标溶液，用乙腈定容，在上述色谱条件下分析，测得呋吡菌胺的回收率为99.56%～101.10%，平均回收率为100.28%(表2)。
表2 分析方法的准确度试验结果
3 结论
本文建立的97%呋吡菌胺原药的高效液相色谱内标分析方法，准确度和精密度高，线性关系良好，具有简便、快速、准确及分离效果好的特点，可作为呋吡菌胺质量检测和质量控制的一种可行的、较理想的分析方法。
