刘凯 李子健

100191 北京大学第三医院心内科，血管医学研究所，国家卫生健康委心血管分子生物学与调节肽重点实验室，分子心血管学教育部重点实验室，心血管受体研究北京市重点实验室

血管重构是许多心血管疾病共有的病理生理过程之一，包括管壁细胞发生增殖、迁移、表型转化、凋亡及细胞外基质合成和降解失衡等，引起血管舒缩功能紊乱[1]。其发病机制包括肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAS)过度激活、活性氧(reactive oxygen species， ROS)的失衡[2]、血流动力学刺激[3]等。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ， Ang Ⅱ)是RAS的主要效应肽，通过激活其受体AT1R(angiotensin type 1 receptor)，促进血管的炎症过程和胶原沉积，导致管壁增厚和血管纤维化，促进血管重构[4]。Ang Ⅱ能加重高血压大鼠的血管重构，拮抗AT1R能减少纤维化[5]。在系膜细胞中，AngⅡ能激活转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)，促进纤维化，但抑制蛋白激酶C和p38丝裂原活化蛋白激酶依赖的通路后，AngⅡ不能促进TGF-β1的激活增加[6-7]。同时，半乳糖凝集素3与AngⅡ诱导的纤维化密切相关。敲除半乳糖凝集素3后，AngⅡ诱导的纤维化受抑制[8]。在培养的成纤维细胞中给予半乳糖凝集素3亦能减少胶原沉积[6，9]，但AT1R及其下游信号介导血管重构中胶原沉积的分子机制尚不清楚。

HIP-55(HPK1-interacting protein of 55 kDa)，也称为SH3P7、mAbp1和DBNL(the adaptor protein Drebrin-like)，是一种含有多个蛋白相互作用结构域的接头蛋白，其N端、C端分别有肌动蛋白结合结构域和SH3结构域。HIP-55在许多细胞生理过程中起重要作用，如细胞信号转导和细胞内吞作用[10]。研究发现HIP-55表达促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[11]、促进中性粒细胞的扩散和迁移[12]、调节发育中大脑皮层中的N-钙粘蛋白表达来控制神经元迁移[13]。我们前期研究发现，HIP-55在异丙(去甲)肾上腺素诱导的心脏成纤维细胞中表达增高，而HIP-55通过肾上腺素受体可抑制心脏成纤维细胞增殖，但HIP-55在血管系统中的功能机制仍不清楚。

1 材料与方法

1.1 实验材料

抗体：HIP-55(sc-366772)购自Santa Cruz公司；GAPDH(2118s) 购自CST公司；Ang Ⅱ(1158) 购自Tocris公司；二周缓释泵(1002)购自Alzet公司；Masson染色试剂盒购自贝索公司。实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0010，所有动物实验遵守北京大学生物医学研究伦理要求。

1.2 方法

1.2.1 Gene Expression Omnibus(GEO)数据库mRNA表达 使用NCBI平台检索HIP-55和Ang Ⅱ，分析AT1R抑制剂坎地沙坦对大鼠高血压模型HIP-55(DBNL)表达的影响。

1.2.2HIP-55基因敲除小鼠构建及鉴定 利用TALEN技术制备HIP-55基因全身敲除小鼠(广州赛业)。设计和构建2～3个不同位点的TALEN载体，并将构建好的TALEN 载体进行体外转录。得到的针对不同位点的mRNA分别注射到B6品系受精卵，显微注射后的受精卵回送到代孕母鼠输卵管中，最终得到经测序鉴定的F1代HIP-55基因敲除小鼠。

提取小鼠尾尖DNA，通过离心抽提获得微量羽毛状DNA，加入去离子水，DNA浓度大致为200 μg/L。PCR：PCR程序设置：98.0℃，30 s；98.0℃，5 s；65.0℃，5 s；72.0℃，7 s(30次循环)；72.0℃，1 min。PCR引物序列如下：上游引物： AAGTGCTGGGATTAAAGGCGTGC。下游引物： GTCACTGTAGCTGAGCTGGAGGAAGA。PCR产物酶切跑胶，结果为基因敲除鼠：约500 bp处有一条带。野生型(WT)鼠：约250 bp处有两条带。杂合子：有三条带，约500 bp处有一条带，约250 bp处有两条带。

1.2.3 小鼠血管重构模型建立及血压监测 通过腹膜内注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，皮下植入AngⅡ的渗透缓释泵14 d(1 mg·kg-1·d-1)。在埋泵前一天及埋泵第7天和第14天，使用大小鼠无创血压仪(BP98A，Softron，日本)测量小鼠血压。

1.2.4 分组 构建HIP-55基因敲除鼠后，将小鼠分为4组：野生/假手术组(WT/Sham组)、HIP-55基因敲除/假手术组(HIP-55-/-/Sham组)、野生/埋泵组(WT/Ang Ⅱ组)和HIP-55基因敲除/埋泵 (HIP-55-/-/Ang Ⅱ组)。

1.2.5 组织形态学检测 小鼠麻醉后处死取材，将血管固定在甲醛中，包埋在石蜡中，并切成厚度为5 μm的石蜡切片。通过苏木素-伊红(HE)染色用于检查血管形态的变化，通过Masson染色评估血管中的胶原沉积情况。

1.2.6 蛋白质免疫印迹分析 将血管组织裂解物进行SDS-PAGE凝胶电泳，并电泳转移到硝酸纤维素膜上。5%牛奶封闭，然后将膜在4℃下孵育HIP-55(1∶1000)和GAPDH (1∶10000)一抗过夜。在室温下二抗孵育1 h后，使用化学发光法显现免疫反应蛋白。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 高血压模型大鼠的HIP-55表达

使用GEO数据库搜索项“HIP-55(DBNL)和Angiotensin”检索原始数据。发现在高血压大鼠模型中给予AT1R抑制剂坎地沙坦，HIP-55的表达量有降低趋势(0.7±0.01比1.0±0.08，P=0.07)，提示HIP-55可能参与AT1R下游信号。

2.2 小鼠血管重构模型

建立血管重构模型后，埋泵前实验组和对照组的血压相似；埋泵后第14天后，实验组小鼠的收缩压[(133.4±3.4)mmHg比(103.0±1.0)mmHg，P<0.001]和舒张压[(103.9±1.0)mmHg比(82.8±0.9)mmHg，P<0.001]均显著升高。与对照组相比，实验组小鼠的血管胶原沉积(3.1±0.18比1.1±0.04，P<0.01)(图1A)、血管横切平均面积(2.7±0.1比1.0±0.04，P<0.01)、平均厚度[(105.7±7.0)μm比(66.0±7.6)μm，P<0.01]、平均厚度/内径(0.28±0.01比0.17±0.01，P<0.01)均明显增加(图1B)，故小鼠血管重构模型构建成功。

2.3 小鼠血管重构模型HIP-55表达水平

与对照组相比，实验组小鼠血管中HIP-55 mRNA(1.6±0.22比1.0±0.03，P<0.01)和HIP-55蛋白表达水平(1.6±0.15比1.0±0.04，P<0.01)均明显增加(图2)，故HIP-55可能参与Ang Ⅱ诱导的血管重构。

2.4 HIP-55促进Ang Ⅱ诱导的胶原沉积

利用TALEN技术建立HIP-55敲除小鼠，使用鼠尾基因型鉴定和Western blot的方法证明HIP-55基因敲除小鼠建立成功(图3A、B)。结果显示：与WT/Sham组相比，HIP-55-/-/Sham组小鼠的血管胶原沉积水平无明显变化(1.1±0.04比1.0±0.05，P=0.70)；给予AngⅡ埋泵后，与WT/Ang Ⅱ组相比，HIP-55-/-/Ang Ⅱ组小鼠的血管胶原沉积程度明显减少(2.6±0.2比3.3±0.1，P<0.05)，故HIP-55介导Ang Ⅱ诱导的血管胶原沉积(图3C)。

A：Masson染色；B：HE染色图1 小鼠血管重构模型构建

图2 小鼠血管重构模型中HIP-55蛋白表达

3 讨论

血管重构是一种复杂而动态的血管刺激反应过程，其发生发展及相关并发症的主要病理基础是血管胶原沉积引起的血管损伤[14]。血管胶原沉积发生的已知机制包括：TGF-β/SMAD信号传导，激活TGF-β及下游的SMAD信号，促进胶原蛋白的合成[15]；ROS的过量生成会促进基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)和结缔组织生长因子的增加，促进胶原沉积，导致纤维化和动脉硬度增加[16]；半乳糖凝集素3的上调可直接增加胶原蛋白的增加，促进胶原沉积[17]。另外，RAS系统通过激活AT1R、盐皮质激素受体和内皮素受体，导致胶原沉积。其中，血管紧张素作用于AT1R，激活MMP、结缔组织生长因子和TGF-β，导致胶原沉积[18]。醛固酮可通过盐皮质激素受体促进胶原沉积。研究发现，在大鼠中，醛固酮能增加胶原沉积；阻断盐皮质激素受体后，能减少心血管的胶原沉积水平[19]，而内皮素1通过内皮素受体促进胶原沉积。阻断内皮素受体可显著减少MMP-2的活性，抑制胶原沉积[20]。在衰老和高血压的过程中，脉管系统最明显的特点是血管胶原沉积，导致纤维化和硬化。

干扰Ang Ⅱ药物，即血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂，能减少血管胶原沉积，降低动脉僵硬度[21]，改善胶原沉积，降低心脑血管事件的发生。因此，减少血管胶原沉积是解决高血压血管重构的有效办法之一。然而，目前尚无较好的干预手段，阐明新的促进胶原沉积的机制是未来干预血管重构的理论基础。目前关于HIP-55的文献报道主要是在器官发育、免疫反应和神经调节等方面起着重要作用，在血管中的作用尚无人报道。我们首次发现在AngⅡ诱导的血管重构模型中HIP-55的表达是增加的，并且HIP-55介导AngⅡ诱导的血管胶原沉积。我们前期研究发现，HIP-55能通过P38 MAPK途径抑制ISO诱导的心脏纤维化。虽然刺激因素以及部位不同，但这也给我们提示，HIP-55是否也会通过P38 MAPK这一途径影响AngⅡ诱导的胶原沉积。因此，HIP-55是如何影响AngⅡ介导的血管胶原沉积还亟待研究[21]。

A：鼠尾基因鉴定结果；B：蛋白水平敲除结果；C：胶原沉积变化图3 HIP-55对Ang Ⅱ诱导的血管胶原沉积影响

本文也有不足之处：(1)AngⅡ诱导的血管重构除了有胶原沉积增加外，还有平滑肌细胞增殖、迁移和表型转化等，本文只研究了HIP-55对AngⅡ诱导的胶原沉积的影响；(2)HIP-55是如何影响AngⅡ介导的血管胶原沉积的进一步机制还亟待研究。总之，本研究发现HIP-55在血管重构模型中增加，表明HIP-55响应血管重构的病理刺激；敲除HIP-55能减少Ang Ⅱ诱导的血管胶原沉积。因此，HIP-55是一个潜在的抑制血管重构的靶点，未来可通过干预血管中HIP-55的表达或抑制HIP-55的活性，进而治疗血管重构。

利益冲突：无