吴 波， 叶 鑫， 陈 林， 杨 进， 张汉超， 刘俊莹， 陈 亮， 刁建军

(1成都市郫都区人民医院泌尿外科， 2四川大学华西医院泌尿外科，成都大学附属医院 3泌尿外科， 4中心实验室， 四川 成都 610000)

肾癌对传统放化疗不敏感使免疫治疗成为研究热点，近年来虽然靶向治疗在肾癌方面有所突破，但免疫治疗仍然是晚期肾癌的标准治疗[1]。免疫治疗尤其是细胞因子治疗可以让一些患者完全缓解，而靶向药物，如酪氨酸激酶抑制剂完全缓解率较低，这源于细胞因子治疗与靶向治疗机制完全不同[2]。靶向治疗的机制是抑制肿瘤细胞增殖生长，而免疫治疗既可抑制细胞增殖，还具有细胞毒作用从而导致肿瘤细胞凋亡。肾癌被广泛认为是免疫原性肿瘤，这正是免疫治疗可以在一些患者中取得长期完全缓解疗效的原因[3-4]。国外最新研究表明，Toll 样受体7(Toll-like receptor 7，TLR7)激动剂可以激活外周血细胞，诱导产生针对皮肤癌的免疫反应[5]。本课题组前期运用TLR7激动剂刺激肾癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，亦发现多种抗肿瘤细胞因子表达增加，表明TLR7激动剂可能在肾癌免疫治疗中有重要价值[6]。本研究在前期基础之上，进一步将TLR7激动剂刺激后的肾癌患者PBMCs与来源于该患者术后标本的原代肾癌细胞共培养，探索TLR7激动剂治疗肾癌的潜能。

材 料 和 方 法

1 病例介绍

患者男，53岁。经根治性肾切除术后病理确诊为肾透明细胞癌，确诊时未发现炎症及其它合并症。研究方案经医院伦理委员会审批通过，批件号《伦委批字2018D1》。

2 方法

2.1PBMCs的分离、培养及刺激 经知情同意抽取肾癌患者血液20 mL，乙二胺四乙酸抗凝，离心分离血浆吸入1.5 mL环氧树脂管中冻存备用。剩余血液用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)稀释，淋巴细胞分离液混匀梯度离心 PBMCs，小心吸取离心管中单个核细胞层，用PBS洗涤 2 次，最后以含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基悬浮细胞并记数,调细胞含量为 2.5×108/L, 加入12孔板中(每孔2 mL)。TLR7 特异性激动剂 gardiquimod(EnzoLife Science)按照操作说明书进行溶解，以10 mg/L的终浓度加入PBMCs 中[6]。

2.2肾癌细胞培养 原代细胞取自该患者肾癌标本，采用混合酶消化法。将3～5代内肾癌细胞接种于孔径为0.4 μm 的12 mm Transwell(Life Sciences)板中(每孔0.5 mL)，Transwell外12孔板中加入含10% 胎牛血清 的 RPMI-1640培养基1.5 mL。贴壁后换无血清培养基同步细胞周期，然后与gardiquimod 刺 激4 h 后的PBMCs共培养24 h。实验分2组进行，分别是实验(gardiquimod)组(gardiquimod 刺 激的PBMCs共培养)和对照(control)组(未刺激的PBMCs共培养)。

2.3ELISA检测培养基中细胞因子水平 将PBMCs与肾癌细胞共培养后，取上层细胞培养液，按照ELISA试剂盒(R&D)说明检测培养液中γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)。比较实验组和对照组3种细胞因子的表达水平。

2.4流式细胞术检测肾癌细胞周期 共培养24 h后将实验组和对照组肾癌细胞消化，离心后弃上清，收取细胞用预冷PBS洗涤2次。加入-20 ℃预冷的70%乙醇1.5 mL，于4 ℃冰箱固定过夜。离心弃上清液，PBS洗涤离心除去乙醇。然后加入500 μL RNase(100 mg/L)37 ℃孵育1 h使双股RNA降解，离心弃上清后加入1 mL溴化乙锭(propidium iodide，PI，50 mg/L)和0.2% Triton X-100避光孵育30 min。实验方法参考秦晓平等[7]报道，以标准程序用流式细胞仪检测肾癌细胞周期，结果用细胞周期软件分析。反应细胞增殖能力的指标按照下列公式计算：细胞增殖指数(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M) × 100%。

2.5[51Cr ]释放实验检测Gardiquimod 刺激PBMCs抗肿瘤活性变化 将实验组和对照组PBMCs作为效应细胞，原代培养的肾癌细胞作为靶细胞，采用标准的 4 h [51Cr]释放实验检测效应细胞的杀伤活性。实验前 24 h传代肾癌细胞作为靶细胞, 取 1 ×105个靶细胞,设置为效靶比40 ∶1、 20 ∶1和10 ∶1，同时设立自然释放孔和最大释放孔。作用时间为4 h,按以下公式计算各组的杀伤率：细胞杀伤活性(%)=[(实验cpm-自放射cpm)/(靶细胞最大cpm-靶细胞自放射cpm)]×100%。

2.6Western blot检测肾癌细胞中Skp2及其下游通路相关分子的蛋白水平 收获共培养肾癌细胞，加入RIPA细胞裂解液(碧云天公司)，操作在冰上进行。将裂解的细胞液移入1.5 mL Ep管中，4 ℃、12 000 r/min离心15 min后吸取上清移入新管。取少量上清进行定量，测定A值并计算蛋白质浓度。将蛋白样品调至等浓度，各组取30 mg蛋白样品，通过SDS-PAGE分离后并转移到PVDF膜(Millipore)上，然后用特异性抗体孵育。检测的蛋白分别是GAPDH、p53、p27、p21和Skp2(Cell Signaling Technology)。采用Image-Pro Plus 6.0软件对Western blot结果进行灰度值测量然后统计分析。

3 统计学处理

用GraphPad Prism软件对资料进行统计分析，计量资料均采用均数±标准差(mean±SD)表示，统计方法采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Gardiquimod 刺激PBMCs后多种细胞因子表达增加

Gardiquimod 刺激的PBMCs与肾癌细胞共培养24 h后，细胞培养基上清液内IFN-γ、TNF-α和 IL-2 3种因子均明显升高，IL-2较对照组升高约3倍，TNF-α较对照组升高约2倍，而IFN-γ较对照组升高约5倍(P<0.05)，见图1。

2 Gardiquimod 刺激的PBMCs可明显抑制肾癌细胞增殖

在共培养24 h后，各个样本用流式细胞术检测,统计分析显示，实验组PBMCs明显抑制肾癌细胞从G1期过渡到S期，细胞的增殖指数从对照组的(51.58±4.90)%下降到实验组的(40.83±4.87)%(P<0.05),见图2。

Figure 1.The expression of IL-2, TNF-α and IFN-γ in culture medium supernatant were detected by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图1实验组与对照组培养基上清液IL-2、TNF-α和IFN-γ的水平

Figure 2.Flow cytometry assay of the cell cycle distribution. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

图2实验组与对照组的细胞周期分布分析

3 Gardiquimod刺激PBMCs后显著提高其对肾癌细胞的杀伤率

实验组PBMCs对肾癌细胞的杀伤率随着效靶比的升高显著提升；然而随着效靶比的升高，对照组PBMCs对肾癌细胞的杀伤率升高不明显。相同效靶比的情况下，实验组较对照组的杀伤率显著提升，随着效靶比从10∶1逐渐提升为40∶1，2组PBMCs对靶细胞的杀伤率都逐渐提升(P<0.05),见图3。

4 Gardiquimod 刺激PBMCs后共培养对肾癌细胞Skp2/p21/p27/p53蛋白水平的影响

我们进一步检测了gardiquimod刺激PBMCs后共培养对肾癌细胞Skp2/p21/p27/p53蛋白水平的影响，结果发现Skp2蛋白水平在实验组明显下降(P<0.05)，下降的规律和细胞增殖指数的变化一致；实验组p27蛋白水平明显增加，与Skp2蛋白水平变化规律相反(P<0.05)，而p21和p53无明显变化，见图4。

Figure 3.Cytotoxicity of PBMCs to the renal cancer cells at different effector-target ratio. Mean±SD.n=3.△P<0.05vseffector-target ratio 20:1 group;#P<0.05vseffector-target ratio 10∶1 group;*P<0.05vscontrol group.

图3在不同效靶比时PBMCs对肾癌细胞杀伤率的比较

Figure 4.The protein expression of Skp2, p21, p27 and p53 in the renal cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图4各组肾癌细胞表达Skp2、p21、p27和p53蛋白水平的比较

讨 论

晚期肾癌的治疗是泌尿界和肿瘤界研究焦点，主要集中在免疫治疗和靶向治疗[8-11]。靶向治疗药物普遍价格昂贵，卫生经济学问题已经成为患者可及性的难题[12]。同时，靶向药物如酪氨酸激酶抑制剂完全缓解率较低，而免疫治疗尤其是细胞因子治疗可以让一些患者完全缓解，这源于细胞因子治疗与靶向治疗机制完全不同[2]。靶向治疗的机制是抑制肿瘤细胞增殖生长，而免疫治疗既可抑制细胞增殖，还具有细胞毒作用从而导致肿瘤细胞凋亡。本研究发现gardiquimod刺激的PBMCs对肾癌细胞有明显的细胞毒作用和抑制细胞增殖作用。提示TLR7激动剂,如gardiquimod可能是肾癌免疫治疗的新型潜在药物。目前未见类似报道。

探索药物作用机制对新药开发至关重要，课题组前期运用gardiquimod刺激肾癌患者PBMCs，亦发现多种抗肿瘤细胞因子基因表达增加，包括IFN-β、IFN-γ、TGF-β、TNF-α和NF-κB。同时发现IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8和IL-10等IL类因子表达增加。研究表明TLR7激动剂可能在肾癌免疫治疗中有重要价值[6]。本研究在前期基础之上，进一步将TLR7激动剂刺激后的肾癌患者PBMCs与来源于该患者术后标本的原代肾癌细胞共培养，发现共培养后培养基上清液内IL-2、TNF-α和IFN-γ确实明显升高。从基因表达和效应水平双重验证了gardiquimod在肾癌中的免疫治疗作用。该研究结果在基底细胞癌中也得到部分印证，另一种 TLR7激动剂imiquimod可以诱导PBMCs产生IFN-α和TNF-α，从而有效杀伤基低细胞癌细胞[13]。国内黄雪等[14]采用TLR激动剂在肺腺癌细胞中也取得相似的实验结果。

免疫治疗抑制肾癌细胞增殖的机制目前尚不清楚。细胞增殖最终依赖于细胞周期的进展，它受到细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIs)的负性调节[15-17]，肾癌细胞所含CDKIs分子种类繁多，包括p53、p21和p27等。有研究报道肾癌细胞增殖和Skp/p27有关[18]，最新的研究发现与p21有关[19]，也有发现与p21和p53同时相关的[20]。为澄清学术界的相关争论，本研究将共培养后的肾癌细胞用于细胞周期检测和Skp2/p21/p27/p53蛋白水平检测，发现gardiquimod刺激PBMCs后可以明显抑制肾癌细胞增殖，同时随着Skp2表达下降肾癌细胞周期停滞，而p27显著增加，p21和p53无明显变化。实验结果证实肾癌细胞周期调控可能与Skp2/p27通路有关。至于Skp2/p27通路的上游调控机制，国内李婷婷等[21]提供了新的研究思路——转录因子 EB(transcription factor EB，TFEB)，将是未来深入研究的方向之一。