李先根，汪 洋，王秀英，朱惠玲，刘玉兰

（武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023）

在免疫应激状态下，机体会合成并释放肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）、白细胞介素 -1β（IL-1β）、IL-6 等炎性细胞因子[1]，这些炎性细胞因子过量释放会导致机体发生炎症反应，使组织损伤或功能紊乱，最终导致动物生产性能下降、发病，甚至死亡[2]。

Toll样受体4（TLR4）信号通路主要包括TLR4、骨髓分化因子88（MyD88）、IL-1受体相关激酶1（IRAK1）等关键基因。NOD信号通路主要有NOD1、NOD2和受体互作蛋白2（RIPK2）等关键基因。研究表明，TLR4和NOD被激活后，可以进一步激活下游相关分子，如核因子-κB（NF-κB），从而诱导炎性细胞因子的过量表达和释放，最终导致机体组织或器官损伤[2-3]。炎性细胞因子还可通过改变叉头转录因子（FOXO）/泛素-蛋白酶体途径（UPP）导致肌肉蛋白质降解[4]。研究发现，FOXO的靶基因，即肌肉环指蛋白1（MuRF1）、肌萎缩F-box蛋白（MAFbx）是调控蛋白质降解的关键基因[5]。研究表明，脂多糖（LPS）可以激活TLR4和NOD信号通路，诱导炎性细胞因子的合成与释放[6]。目前，关于LPS对肠道、肝脏等组织TLR4和NOD信号通路影响的研究只集中于单个时间点，尚未有动态规律研究。因此，本试验旨在探究LPS刺激后不同时间断奶仔猪肌肉炎症和蛋白质降解相关基因表达的变化规律，为寻找缓解免疫应激的方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 LPS：大肠杆菌血清型055：B5，购于Sigma公司，以100 μg/kg体重（BW）剂量注射。

1.2 试验动物与设计 选择42头（7.1±0.9）kg杜×长×大三元杂断奶仔猪，按注射LPS之前（0 h）和注射LPS后1、2、4、8、12、24 h随机分为7个处理，每个处理6头猪。预试14 d后，腹腔注射100 μg/kg BW的LPS，全部麻醉、屠宰，取背最长肌样品待测。

1.3 mRNA表达分析

1.3.1 主要仪器与试剂 7500实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）仪（Applied Biosystems）、梯度升降温功能PCR仪（TaKaRa）、Nanodrop 2000超微量分光光度计（Thermo）、Tanon-4100凝胶成像系统（上海天能）；RNAiso Plus（Total RNA提取试剂）、PrimeScript®RT reagent kit with gDNA eraser（cDNA合成试剂盒）和SYBR®Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（real-time PCR试剂盒）均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3.2 测定方法 组织总RNA提取、cDNA合成、Real-time PCR参照陈少魁等[8]的方法。Real-time PCR数据计算采用Livak等[9]的2-ΔΔCt法，以肌动蛋白（β-actin）为内参基因。

1.3.3 引物设计与合成 TNF-α、TLR4、MyD88、IRAK1、NOD1、NOD2、RIPK2、NF-κB基因的引物序列参照陈少魁等[8]。IL-1β、IL-6、FOXO-1、FOXO-4、MuRF1、MAFbx、β-actin引物序列见表1。

1.4 统计分析 数据采用SPSS 17.0统计软件进行独立样本t检验分析，结果用平均值±标准误来表示。以P＜0.05表示差异显著，P＜0.10表示具有显著性趋势。

2 结 果

2.1 LPS对仔猪背最长肌TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达量的影响 由表2可知，与对照组（0 h）相比，注射LPS 1 h后TNF-α、IL-1β mRNA表达量达到峰值（P＜0.05），2 h后IL-6 mRNA表达量达到峰值（P＜0.01)。

2.2 LPS对仔猪背最长肌TLR4和NOD信号通路关键基因mRNA表达量的影响 由表3可知，与对照组（0 h）相比，注射LPS导致大多数TLR4和NOD信号通路基因表达上调，其中，在2～4 h，TLR4、MyD88、NOD2、RIPK2 mRNA表达量达到峰值（P＜0.05)。

2.3 LPS对仔猪背最长肌肌肉蛋白质降解相关基因mRNA表达量的影响 由表4可知，与对照组（0 h）相比，注射LPS 12 h后FOXO-1、FOXO-4、MuRF1、MAFbx mRNA表达量达到峰值（P＜0.05）。

3 讨 论

从腹膜注射一定剂量的LPS是构建仔猪免疫应激模型最经典的方式[10]。Zhu等[11]研究发现，注射LPS 4 h后，仔猪肠道出现不同程度的损伤，并导致小肠绒毛脱落、屏障功能受损，小肠炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达量显著升高。Liu等[12]研究表明，注射LPS 4 h后，仔猪肝脏TNF-α mRNA表达急剧增加，导致肝脏结构和功能损伤。本研究结果显示，背最长肌中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达量在LPS刺激1～2 h后达到峰值，4 h后表达量也显著升高。这表明注射LPS后首先会刺激肌肉合成并释放过量的炎性细胞因子[6]。

Fukata等[7]研究发现，TLR4和NOD信号通路在先天性免疫反应中起关键作用，并可以调节获得性免疫，但是该信号通路的过度激活也会带来一系列不利影响。Lee等[13]研究发现，很多疾病的发生与这2条炎症信号通路的过度激活相关，如脓毒症、炎症性肠病和感染性休克等。涂治骁等[14]研究发现，注射LPS 4 h后，仔猪肝脏中NOD1、NOD2、RIPK2、NF-κB等基因mRNA表达量显著升高。王海波等[15]研究也发现，注射LPS 4 h后，仔猪下丘脑、垂体、肾上腺等组织NOD1、NOD2、RIPK2、TNF-α 等 基 因 mRNA 表达量显著升高。本试验结果显示，背最长肌中TLR4、MyD88、NOD2、RIPK2的mRNA表达量在注射LPS 2～4 h后达到峰值，这表明LPS刺激后机体首先合成并释放过量的炎性细胞因子，随后使TLR4和NOD炎症信号通路关键基因mRNA表达显著上调。

UPP主要降解胞内蛋白，是体内重要的转录后蛋白修饰手段。在UPP途径中，MAFbx和MuRF1是调节肌肉蛋白质降解的重要因子[5]。肌肉蛋白质发生降解时，FOXO去磷酸化加强，促进MAFbx和MuRF1的表达，最终导致肌肉萎缩[4]。Tamrakar等[16]研究发现，TLR4、NOD以及NF-κB过度激活可以使肌肉蛋白质发生降解，同时能阻止肌肉萎缩后肌纤维的再生。本试验结果显示，背最长肌中肌肉蛋白质降解相关基因FOXO-1、FOXO-4、MuRF1、MAFbx的 mRNA 表达量在注射LPS 12 h后达到峰值。这表明LPS刺激后肌肉合成并释放过量的炎性细胞因子，使TLR4和NOD炎症信号通路关键基因及肌肉蛋白质降解相关基因mRNA显著表达，从而影响机体的正常生长和发育。

表3 LPS对仔猪背最长肌TLR4和NOD信号通路关键基因mRNA表达量的影响

表4 LPS对仔猪背最长肌肌肉蛋白质降解相关基因mRNA表达量的影响

4 结 论

LPS刺激诱导肌肉炎性细胞因子大量表达，使TLR4和NOD炎症信号通路关键基因及肌肉蛋白质降解相关基因mRNA显著表达。