李志强，徐高青，石丽颖，王 军，吕文发

（吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林省反刍动物繁育生物技术与健康养殖工程实验室， 吉林长春 130118）

褪黑素（Melatonin，MT）主要是由松果体合成和分泌的一种吲哚类神经内分泌激素，化学成分是N-乙酰基-5-甲氧基色胺。近年来，大量文献表明MT具有控制生理节律、抗衰老、抗炎和抗细胞凋亡等多种生理功能[1-2]。MT不仅可抑制小鼠心肌细胞及椎体终板软骨细胞的凋亡[3-4]，还可促进人NB4及大肠癌细胞凋亡[5-6]，即MT具有双向作用，对肿瘤细胞有促凋亡作用，对正常细胞有抗凋亡作用。MT主要通过激活2种膜受体MT1和MT2调节机体的生理功能[7]。核受体RORα是视黄酸相关孤儿核受体的一员，在多种组织的分化和发育中发挥重要的作用[8]，而MT已经被证明是RORα的天然配体，被称为褪黑素核受体RORα[9]。有证据表明，MT的免疫调节和抗肿瘤作用主要是通过RORα途径发挥作用[10-11]，RORα在调节生物钟及睾酮分泌中也起着重要作用，而最近Gulec等[12]研究发现，RORα在人THP-1细胞中参与了细胞凋亡，但RORα在MT抑制睾丸间质细胞凋亡中的作用尚不清楚。本实验旨在研究核受体RORα对小鼠睾丸间质细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及处理 本实验采用小鼠睾丸间质细胞系TM3，用5%马血清、2.5%胎牛血清及1%双抗为培养基，在37℃，5% CO2培养箱中进行培养。提前1 d传代TM3细胞，待细胞贴壁后，用无血清培养液（对照组）、MT、MT+核受体RORα拮抗剂SR1001、SR1001处理小鼠睾丸间质细胞36 h。

1.2 MTT法检测细胞活力 在已处理好的细胞中加入5% MTT溶液20 μL，培养4 h后弃掉上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡至结晶消失，酶联免疫检测仪吸光度490 nm处检测细胞活力。

1.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 按照BD公司凋亡检测试剂盒要求，将处理好的细胞用PBS洗1遍，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，加入 200 μL 1×Buffer及碘化丙啶(PI)、异硫氰酸荧光素（FITC）各5 μL，放置培养箱中孵育20 min ，再加入 200 μL 1×Buffer，过滤至流式管中，利用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。

1.4 实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因表达 采用RNAiso Plus法提取细胞的总RNA，反转录为cDNA，用于实时荧光定量PCR实验。按照TaKaRa反转录试剂盒要求，检测RNA的浓度及OD 值，每1 μg RNA反转20 μL 体系的cDNA。本实验检测细胞凋亡相关的Bcl2、Bax基因引物序列见表1。引物序列由上海生工生物技术有限公司设计并合成，并利用 PCR 仪进行引物验证，寻找引物的最适反应条件。利用荧光定量PCR检测在不同处理TM3的情况下Bcl2、Bax的mRNA表达量，荧光定量PCR反应体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL（1×）、 Forward primer 0.8 μL（0.2 μmol/L）、Reverse primer 0.8 μL（0.2 μmol/L）、 ROX reference Dye Ⅱ 0.4 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 至 20 μL。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，59℃退火34 s，95℃复性15 s，扩增 40个循环。

表1 引物序列

1.5 统计分析 采用GraphPad Prism 5.0软件进行t检验，比较组间差异性，数据用平均值±标准差表示，P＜0.05 表示显著差异，P＜0.01 表示极显著差异，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 小鼠睾丸间质细胞活力 如图1所示，与对照组相比，加入MT可以极显著提高小鼠睾丸间质细胞活力（P＜0.01），MT+SR1001组细胞活力较MT组显著下降（P＜0.05），SR1001组细胞活力与对照组无差异，说明拮抗剂自身对细胞活力不产生影响。

图1 MTT法检测小鼠睾丸间质细胞活力

2.2 细胞凋亡率 如图2所示，与对照组相比，添加MT可以显著降低小鼠睾丸间质细胞凋亡率（P＜0.05），MT+SR1001组细胞凋亡率较MT组极显著上升（P＜0.01），RORα组与对照组没有差异，说明拮抗剂自身对细胞凋亡不产生影响。

图2 流式细胞术检测小鼠睾丸间质细胞凋亡率

2.3 凋亡相关基因的表达 如图3所示，与对照组相比，加入MT后，可上调Bcl2（P＜0.01）、下调Bax基因的表达水平（P＜0.05）；与MT组相比，MT+SR1001可上调Bax基因的表达水平（P＜0.05），Bcl2基因则极显著下降（P＜0.01）；SR1001组Bcl2、Bax基因的表达水平与对照组无差异，说明拮抗剂自身对细胞凋亡的基因表达不产生影响。

图3 Bcl2、Bax mRNA相对表达量

3 讨 论

MT可通过膜受体MT1和MT2调节细胞凋亡[7]，但RORα是否参与这一过程尚不明确。本研究发现，MT可抑制细胞凋亡提高细胞活力，添加SR1001后，间质细胞凋亡率又显著上升，细胞活力显著下降，这些结果提示MT可通过核受体RORα途径抑制睾丸间质细胞凋亡。

有关RORα在MT抑制睾丸间质细胞凋亡中的作用尚未见报道，但对其他细胞的研究证明MT可通过RORα调节机体的生理功能。He等[13]在研究RORα在MT保护心肌中的作用时发现，RORα表达降低会促进心肌缺血再灌注诱导的内质网应激、线粒体损伤和自噬功能障碍，增加心肌梗死面积，促进细胞凋亡，证明RORα是作为MT保护心脏的重要介质。Coban等[12]研究表明，RORα在细胞凋亡中起着重要作用，其通过各种途径参与细胞凋亡的调控。Wang等[14]研究发现，用蛋白激酶（AMPK）激活剂AICAR处理可提高RORα表达，导致人胃癌细胞凋亡，并证明RORα是胃癌介入治疗的潜在靶点。Kim等[15]研究发现，RORα通过P53调节了细胞凋亡，并阐明RORα通过调节p53功能发挥潜在抑癌作用的机制。同样，Deng等[16]研究发现，在山羊的精原干细胞中，添加RORα拮抗剂后会导致单倍体精子细胞的形成及类固醇激素的生成显著降低。Zhao等[17]在研究内蒙古绒山羊毛囊中没有检测到褪黑素膜受体的表达，但检测到RORα的表达，并证明MT可通过RORα促进绒山羊毛囊的生长。Garcia等[18]研究发现，RORα缺乏导致糖尿病引起的心脏舒张功能障碍显著增加，相比之下，RORα水平恢复后显著改善了心脏功能。这些研究都证明MT可通过RORα发挥作用，与本研究的结果一致。本研究结果证明MT可通过RORα途径抑制小鼠睾丸间质细胞凋亡，但其作用机制尚需进一步研究。