侯胜奎，陶晨雨，胡慧艳，刘 津，张 婧，贾 青,2,3*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000；2.国家北方山区农业工程技术研究中心，河北保定 071000；3.河北省山区农业工程技术研究中心，河北保定 071000）

动物性别控制技术简称性控技术，是人为控制动物的繁殖过程,主要是对X、Y精子进行有效分离，用分离后的精子对母畜授精，从而生产出符合预期的性别后代。性别控制不但能够帮助人类减少性遗传疾病的发生，而且可以挽救濒临灭亡的珍惜动物[1]，更重要的是可以使乳用动物多产母畜、肉用动物多产公畜，满足人们的生活需要，促进畜牧业发展[2]。如何快速、高效地分离精液成为提高性别控制技术水平的探索热点。对于精液分离，不论是分离方法的创建，还是方法优化，都离不开快速、有效的精液评价体系作为技术保证。本文综述了流式细胞仪分离精液的研究进展及精液纯度评价方法，以期为新方法的探索提供参考。

1 精液分离方法的发展

1925 年，Lush[3]依据兔子精液之间存在的密度差别，使用离心法对兔子后代的性别进行研究。此后，研究人员依据X、Y精子之间存在的物理差别进行了多次试验探索，最后都没有达到预期效果，并且可重复性很差。Blecher等[4]通过区别牛精子的特异蛋白方法分离牛精液，得到雄性犊牛比例大于90%。1970年，Barlow等[5]首次报道在Y精子上发现了F小体，并认为F小体在人和家畜精子上都存在，后来证实F小体只存在于Y精子上。李馨等[6]引述Cardon电泳法对兔子精液进行电泳，取阳极精液授精，所产仔兔中雌兔占74.3%，阴极精子授精雌兔为15.1%。王亚光[7]将兔H-Y抗体清按1∶32输入发情母兔的阴道内10～15 min后，让公兔与其自然交配，所生产的2只仔兔均为雌性。随着研究人员的不断探索和改进，采用流式细胞仪分离法生产性控精液已经步入商业化生产。

1.1 流式细胞仪分离精液的原理 流式细胞仪按照X、Y精子在DNA含量上的差别对其进行筛选，可对精子进行有效分离。研究表明，哺乳动物Y精子的DNA含量少于X精子，牛、马、羊、猪等动物X精子染色体DNA含量分别比Y染色体多3.8%、4.1%、4.2%、3.6%[8]。

首先对采集的动物精液进行过滤、稀释等处理，而后与荧光染料（Hoechst33342）共同染色，经过染料染色能够顺利抵达精子的脂质膜，并且与DNA双链小沟的AT富含区相结合。因X、Y精子的DNA含量不同，所以荧光染料在X、Y精子上的染色程度不同，当仪器对精液进行分离时，经过荧光染料染色的X、Y精子通过仪器上紫外激光的照射，会出现蓝色的激发光，而此时精子被仪器定位，计算机和仪器会根据精液发出的荧光强度的不同做出分析和判断。当含有精液的液滴经过激光进行照射之后，X精液（正）或Y精子（负）会被赋予不同的电荷，带有电荷的精子会借助仪器上的偏斜板（电场）通过持续电流的偏振电场使含有不同电荷的精子发生偏转，把X精子、Y精子以及无法辨别或者死掉的精子分别引导进相应的收集管中（图1）。

图1 流式细胞仪工作原理示意图

1.2 流式细胞仪分离精液的发展过程 20世纪60年代，流式细胞仪检测细胞DNA的微小差异作为一种技术发展起来。Pinkel等[9]1982年开始对小鼠进行研究，发现小鼠X、Y精子DNA含量差异为3.2%。最初，流式细胞仪用来分离精子的头部，直到Johnson等[10]对之前的流式细胞仪进行了改良，使其不单可以分离精子的头部，也可以对活精子进行有效分离，改良后分离效率大大提高。1991年，Johnson[11]经流式细胞仪顺利分离出猪的性控精子，受精后产出雌性仔猪的比例为74%。尔后，多种动物的精液经过流式细胞仪成功分离，并使母畜顺利产出了后代[12-17]。

随着科研技术水平的发展，研究人员对仪器的喷嘴、电场等系统进行了改良，并结合电压调整，分离效率大大提高。目前，经过改良的新型流式细胞仪分离准确度有很大提高，分离的精液准确度维持在90%左右，每小时可分离各类精子2 800多万个[18]。美国XY公司经过改进独家制造生产了SX-MoFlo精子分离机，改良后的流式细胞仪每分钟可分离24万～30万个有效精子[19]。1997—1999年，Seidel等[20]对 11头公牛的精液进行流式细胞仪分离，使用冷冻保存后的分离精液对母牛人工授精，结果发现，使用X精子授精的牛生产母犊的比例达83%、用Y精子授精的牛生产公犊的比例为90%；使用冷冻分离精液牛的妊娠率比对照组牛低20%，但使用冷冻精液对受体牛的产犊情况（犊牛体重、犊牛健康等）和对照组相比没有显著差异。研究人员采用流式细胞仪分离法对伊比利亚红鹿的精液进行分离，采用分离后的Y精子进行人工授精，雄性仔鹿准确率为93%，用未分离的精子进行人工授精，雄性仔鹿准确率为55%[21]。有学者采用微流路精子分离器（Microfluidic Sperm Sorter，MFSS）对分选后的牛性控精子分离，精液样本通过MFSS分离后，精子活力和直线速度都显著提高，可以为奶牛体外受精提供优质的精子[22]。21世纪初，英国Cogent公司使用流式细胞仪分离技术对动物的精液进行分离、生产，分离后的性控精液被推广到商业市场。

中国对精液分离技术的开展起步较晚，但发展很快，有些领域经过近几年的不懈努力取得了卓越成果，达到了国际领先水平。广西大学于2002年在国外首次引进流式细胞仪及相关设备，在卢克焕教授的带领下成立了研究团队，开始着手研究水牛的性控精液。Lu 等[23]把水牛精液利用流式细胞仪进行分离，然后用分离后的水牛精液进行授精，世界首例性控试管水牛在广西大学诞生。中国作为畜牧业大国，对性控精液的需求量比较大。2003—2005年，行业内有关公司分别在国外购置了多台流式细胞仪，起初只分离牛精液，后来逐步扩展到羊等动物，性控精液在全国进行商业化推广取得了不错的成绩。赵宪林等[24]对奶牛性控精液生产工艺进行了改进，改进后精子活力、顶体完整率和母牛受胎率都有所提高，所生产性控精液的有效精子含量明显增加。性控精液在中国未来养殖发展中有相当大的潜力。

随着性控精液的研究发展，中国许多地区的规模化养殖场利用分离的性控精液进行配种[25-26]，在牛、羊等动物精液分离上取得了一定进展，但在猪上研究较少。猪精液由于X、Y精子DNA之间的差异相对于牛、羊更小，所以分离难度更大。2006年，曾有权等[27]利用流式细胞仪对猪精液进行分离，然后采用输卵管法对陆川母猪进行授精，输Y精子的1头母猪共产6头仔猪，仔猪全为雄性，性别准确率为100%；输X精子的3头母猪，窝产仔数分别为5、4、3头，准确率为91.67%，产仔性别与精子分离结果相符。2018年，幸宏超[28]对萨能奶山羊的X、Y精子进行分选，发现最佳染色液为34 μL，有效染色区域百分比和X精子百分比分别为70.93%和29.75%，优于染色液用量为32、36 μL。孙凤俊等[29]研究发现，在蒙贝利亚种公牛性控精液冷冻稀释液中添加谷胱甘肽（终浓度0.75 mmol/L）可以显著提高冻后精子活力。

2 性控精液纯度评价法

2.1 出生性别鉴定评价法 评价精子分离纯度最原始的方法是通过统计出生仔畜性别比例来判定，这种方法在早期试验中应用比较多[30]。Seidel等[31]利用流式细胞仪对牛精液进行分离，然后用分离的性控精液对实验母牛进行人工授精，X精子和Y精子受精的准确率分别为83%和90%。丁伟良[32]选用X性控精液对597头奶牛进行配种，共有579头成功产犊，其中公犊有46头，母犊533头，X性控精液准确度为92.06%。出生性别鉴定评价法是相当可靠的，但周期太长，例如牛需280 d、猪需114 d、兔需30 d左右、羊需148 d。出生性别鉴定评价法不利于精液纯度评价方法的优化，同时，在动物授精过程中也可能导致精液的损伤死亡，从而影响准确度，由于所出生后代的性别无法判定，可能会导致人员、资金等浪费[33]。

2.2 胚胎性别鉴定评价法 胚胎性别鉴定评价法主要依靠医学、遗传学和生物学为基础对胚胎的性别进行鉴定，该鉴定法被认为是目前最准确的评价法之一，在实验中胚胎性别鉴定法比较常用。

2.2.1 胚胎分子生物学评价法 胚胎分子生物学评价法是对胚胎细胞Y染色体进行检测，检测Y染色体上是否存在性别特异基因SRY等，从而对精液分离准确度作出判断，在检测过程中有特异信号的为雄性，反之则为雌性。胚胎分子生物学评价法具有检测灵敏度高、速度快、准确性高等特点。胚胎分子生物学评价法分为胚胎细胞荧光原位杂交法和PCR胚胎性别鉴定法。胚胎细胞荧光原位杂交法需要找到性染色体上的特异DNA，并用探针标记，而后用特异DNA与胚胎细胞进行原位杂交，根据杂交结果统计胚胎性别，依据胚胎性别的比例计算精液分离的准确度。PCR 胚胎性别鉴定评价法需要找到SRY等特异基因，依据特异基因序列设计引物，取胚胎样品进行PCR扩增，对PCR产物进行凝胶电泳检测，根据电泳结果来判定胚胎性别。曾溢滔等[34]根据牛 SRY特异基因对奶牛进行了相关的胚胎性别鉴定，共有17枚胚胎参加了鉴定，鉴定准确度达到100%。使用 PCR胚胎性别鉴定评价法鉴定用时比较短，准确度也比较高，此法能够准确地对精液的分离纯度进行有效评价，很有推广价值[35]。

2.2.2 胚胎免疫学评价法 胚胎免疫学评价法是应用H-Y 单克隆抗体或H-Y 抗血清与胚胎细胞免疫反应辨别胚胎的性别，经过对胚胎性别比例进行统计得出性控精液的准确度。胚胎免疫学评价法分为间接荧光免疫法和囊胚形成抑制法。White 等[36]对牛的胚胎采用间接荧光免疫法进行检测，X 精子授精准确率为89%，Y 精子授精准确率为 79%。Ramalho等[37]运用囊胚形成抑制法对奶牛胚胎性别鉴定的结果显示，X 精子授精准确率为81.82%，Y精子授精准确率为80%。间接荧光免疫法对胚胎性别的鉴定也存在不足，实验者会因为个人因素影响鉴定准确度；囊胚形成抑制法对发育慢的雌性胚胎很难分辨，容易造成误判，影响实验结果；不同物种在进行免疫原性和H-Y 抗原实验时由于本身的特异性会造成结果差别很大。

2.2.3 胚胎细胞学检测评价法 胚胎细胞学检测评价法需要在胚胎滋养层上采取部分细胞，然后使用秋水仙素进行处理，当有丝分裂到达中期时，对细胞进行固定染色，用显微镜观察细胞核型，依照Y染色体存在与否推断性控精液的准确度，这种方法的准确度可达100%。Monk 等[30]利用胚胎细胞学检测评价法对老鼠的性控比例进行验证，结果表明雄鼠的准确率为100%（3/3），雌鼠的准确率为91%（11/12）。然而核型分析和显微切割对操作者的技术有较高要求，稍有不慎就会造成实验失败。

2.3 流式细胞仪重分析评价法 流式细胞仪重分析法指对已经分离过的精液用流式细胞仪再次分离，以确定精液分离的准确度。重分析之前需要对精子做超声波处理，为了提高精子的定向效率，需要把精子尾部去掉，用荧光染料对需要重新分离的精子再次染色，然后再次分离，验证精子分离的准确性。有研究人员利用该方法检测约克公猪的性控精液，性控精液经过流式细胞仪重分析后X 精子纯度为 88%、活力为 35%，Y 精子的纯度为83%、活力为 21%[38]。流式细胞仪重分析法可信度十分高，然而当物种X、Y 精子之间 DNA 含量差别小于3%时，分离就会有很大难度[39-40]。目前流式细胞仪在牛上利用较多，DNA含量差别比较小的动物精液分离难度较大，分离准确度会受到影响，并且流式细胞仪价格比较昂贵，一般实验室难以配置。

2.4 荧光原位杂交评价法 荧光原位杂交评价法又称为FISH评价法，它是以碱基互补性为基础原理，首先找到细胞核中相应染色体序列，并对非放射性荧光物质染色体标记，把染色体序列与标记荧光染色体的特异核酸探针杂交，在荧光显微镜下把X、Y精子进行有效区分[41]。Hamano等[42]对牛的精液进行断尾处理，经分离的精液用FISH评价法对其纯度进行鉴定，测得Y精子纯度可达82%，利用显微注射技术对体外成熟的牛卵母细胞进行显微注射，所生产后代中雄性小牛占80%。FISH评价法不但准确度高，而且探针比较稳定，所用试剂无毒害，但鉴定过程较长，而且对试剂要求也比较严格，鉴定成本高昂[43]。

2.5 PCR 评价法 PCR评价法是短时间内把目标 DNA片段进行大量富集，微弱的性别特异信号得到放大，然后对扩增的片段进行凝胶电泳检测，可以鉴别出精子的性别，最后评价出精子分离的纯度。Brien等[44]用流式细胞仪分离大猩猩的精液，用单精子PCR鉴定X精子纯度，X精子纯度为89.7%，外观形态正常率为79%。

研究人员使用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）验证牛X和Y精子的纯度，其原理是在PCR反应体系中加入相应的探针，利用荧光探针在PCR上进行扩增，根据每一个循环的扩增，检测PCR的产量，通过计算机处理，PCR扩增的产物曲线可以被描述出来，X和Y精子的比例也可从曲线推断出来[45]。Parati等[46]采用实时荧光定量PCR检测牛精液纯度，并与流式细胞仪重分析结果比较，两者评价结果无显著差异。可见实时荧光定量PCR评价法也是相当准确的，但是该评价法需要特定的仪器，并且不能直接获得精液纯度，需要间接推测，实验花费比较昂贵，从而影响其推广。而单精子巢式 PCR 评价法对实验相关仪器条件等要求不高，操作方法容易上手，但对每个精子都需要PCR 检测，且对检测的时间、试验的准确性、灵敏性等要求很高，稍有不慎，就会影响检测结果。Khamlor等[47]使用多重实时PCR (The multiplex real-time PCR)检测牛精子中的性别比例，多重实时PCR中，X和Y对应的扩增效率分别为97%和99%；分离管单纯实时PCR (The separated-tube simplex real-time PCR) 中X和Y对应的扩增效率分别为99%和97%，二者没有显著差异，因此，本研究中显示的多重实时PCR测定可用于评估性别分选的精液纯度。

3 展 望

流式细胞仪分离法在动物X、Y精子分离上的应用提高了精液的分离效率和分离的准确度，目前国际上已经有多家公司利用流式细胞仪进行商业化生产动物性控精液。优良种畜的性控精液对推动全球畜牧业发展起到至关重要的作用，然而流式细胞仪价格不菲，精液分离要求的技术也比较高，导致分离的性控精液比较昂贵。随着流式细胞仪的不断改进，分离效率逐渐提高，成本会越来越低，有助于性控精液的大规模推广应用。同时，性控精液纯度评价方法也有很多不足之处，严重影响了推广速度，例如胚胎性别鉴定法、流式细胞仪重分析法等操作过程繁琐、价格昂贵。随着科学技术的进步及分子生物学、医学等相关领域的发展，流式细胞仪分离精液的准确度会有所提高，分离后的性控精液活力和受孕成功率都将提高，从而为各种精液纯度评价法的准确性做好基础，为促进畜牧业的发展做出贡献。