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富血小板血浆(PRP)对大鼠光老化皮肤胶原蛋白、TGF-β及MMP-1表达的影响

2019-04-15吴文伯陈敏亮吴焱秋李光磊

中国美容医学 2019年4期
关键词:空白对照胶原生理盐水

吴文伯 陈敏亮 吴焱秋 李光磊

[摘要]目的:通過测定注射富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)后大鼠光老化皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,转化因子β(TGF-β),基质金属蛋白酶1(MMP-1)的表达量,观察PRP对大鼠光老化皮肤的改善作用。方法:通过紫外线照射大鼠背部皮肤建立皮肤光老化模型。将模型动物随机分为5组,A-PRP注射组注射激活的PRP(A-PRP);N-PRP注射组注射未激活的PRP(N-PRP);生理盐水注射组注射生理盐水;空白对照组仅照射建模;正常大鼠组仅剃除毛发。干预4周后,通过免疫组化法对大鼠皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量进行半定量分析;通过Western bolt法对大鼠皮肤TGF-β、MMP-1表达量进行测定。结果:Ⅰ型胶原表达:A-PRP注射组较N-PRP注射组、生理盐水注射组、空白对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅲ型胶原表达:A-PRP注射组显著高于生理盐水注射组、空白对照组(P<0.05),与N-PRP注射组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。TGF-β表达:A-PRP注射组显著高于N-PRP注射组、生理盐水注射组、空白对照组(P<0.05);MMP-1表达:A-PRP注射组显著低于生理盐水注射组、空白对照组(P<0.05),与N-PRP注射组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:注射PRP可以提高光老化大鼠皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和TGF-β表达,降低MMP-1表达,其中A-PRP对Ⅰ型胶原和TGF-β表达的促进作用优于N-PRP。

[关键词]富血小板血浆;光老化;Ⅰ型胶原;Ⅲ型胶原;TGF-β;MMP-1

[中图分类号]R758.1    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455(2019)04-0064-04

Abstract: Objective  The effect of PRP on photoaging skin of mice was observed by measuring the expression of type Ⅰand type Ⅲ collagen, TGF-β, MMP-1 in the skin of mice after PRP injection. Methods   Skin photoaging model was established by irradiating the skin of the back of rats with UV light. A-PRP injection group was injected with activated PRP (A-PRP). N-PRP injection group was injected with inactive PRP (N-PRP). Saline injection group was injected with normal saline. Blank control group was irradiated only with UV. Normal rat group only shave the hair. After injection for 4 weeks, the content of collagen type Ⅰ and Ⅲ in rat skin was semi-quantitatively analyzed by immunohistochemistry. The expression of TGF-β and MMP-1 in rat skin was determined by Western blot. Results  The expression of type Ⅰ collagen in A-PRP injection group was significantly higher than that in N-PRP injection group, saline injection group and blank control group, the differences were statistically significant(P<0.05). The expression of type Ⅲ collagen in A-PRP injection group was significantly higher than that in group saline injection group and blank control group(P<0.05), and there was no significant difference between A-PRP injection group and N-PRP injection group(P>0.05). The expression of TGF-β in A-PRP injection group was significantly higher than that in N-PRP injection group, saline injection group and blank control group(P<0.05), the expression of MMP-1 was significantly lower in A-PRP injection group than that in saline injection group and blank control group(P<0.05). The expression of MMP-1 in A-PRP injection group and N-PRP injection group had no statistical significance(P>0.05). Conclusion  Injection of PRP can enhance the expression of type Ⅰ collagen, type Ⅲ collagen and TGF-β and decrease the expression of MMP-1 in the photo-aged rat skin. The effect of A-PRP on the expression of type Ⅰ collagen and TGF-β is better than that of N-PRP.

Key words: platelet-rich plasma(PRP); photoaging; type Ⅰ collagen; type Ⅲ collagen; TGF-β; MMP-1

皮肤老化分为内源性老化和外源性老化,内源性老化是机体固有的老化,受激素水平等内源性因素影响;外源性老化是皮肤在外界环境因素作用下产生的老化,其中紫外线照射是最主要的影響因素,因此外源性老化也称为光老化[1]。相关研究表明,紫外线照射可以上调基质金属蛋白酶MMP-1表达,加快Ⅰ型胶原分解,使Ⅰ、Ⅲ型胶原比例下降,导致皮肤出现老化表现[2]。

PRP是自体血小板浓缩物,血小板含量是全血的3~8倍,其中富含包括TGF-β在内的多种生长因子[3]。TGF-β能够有效刺激成纤维细胞和间叶母细胞的迁移和增殖分化,促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成[4]。PRP在骨科、颌面外科、口腔科等领域已经得到了广泛的应用,目前,随着皮肤光老化相关研究的深入,PRP在改善皮肤光老化中的研究和应用也受到关注[5]。本课题将探讨PRP对光老化皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,TGF-β及MMP-1表达的影响。

1  材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂:UVA紫外线灯管(飞利浦公司);UVB紫外线灯管(飞利浦公司);紫外线强度测定仪(台湾路昌);脱水机(武汉俊杰电子有限公司);包埋机(武汉俊杰电子有限公司);病理切片机(德国徕卡);显微镜(日本尼康);凝血酶冻干粉(长春雷允上药业有限公司);枸橼酸钠注射液(天津金耀氨基酸有限公司);CollagenⅠ抗体(Abcam公司)Collagen Ⅲ抗体(Abcam公司);TGF-β抗体(Abcam公司);MMP-1抗体(Abcam公司);牛血清蛋白Ⅴ(Solarbio公司)。

1.1.2 动物:选取6周龄雄性F344大鼠为模型动物,数量50只,其中30只用于实验,20只用于采血。购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮肤光老化模型建立:大鼠5只一笼,于20℃~25℃室温常规饲养,室内光照与昼夜相符。首先进行1周的适应性饲养后,剃除大鼠背部毛发,于自制照射箱中进行照射,根据实验情况和文献报道的照射方案,每周照射5d,累计照射60d[6-8]。起始每天照射15min,每隔10d增加5min,自31d起保持每天30min照射至建模结束。UVA强度:1 500μW/cm?,累计约135J/cm?;UVB强度:150μW/cm?,累计约13.5J/cm?。建模完成后采集皮肤图像和组织标本,对光老化模型进行评价。

1.2.2 富血小板血浆的制备:4%水合氯醛溶液腹腔麻醉大鼠后,剃除胸部毛发后常规消毒,使用预先吸入0.3ml枸橼酸钠溶液的5ml注射器穿刺至左心室,抽取动脉全血3ml,合计60ml,置于5ml离心管中离心。首次以200g离心10min,吸取全部上清液及交界面下3mm液体,置于另一离心试管中进行再次离心,200g离心10min,弃去上3/4液体,剩余1ml摇匀,既得PRP,取少量用于血小板计数。所制得的PRP随机分为2组,一组以凝血酶、10%氯化钙混合物予以激活,得到凝胶状的A-PRP;另一组不予激活,为N-PRP。

1.2.3 PRP注射治疗大鼠光老化皮肤:完成建模后,大鼠常规饲养1周后实施干预。模型大鼠随机进行分组,每组6只。分别为A-PRP注射组,N-PRP注射组,生理盐水注射组,空白对照组,除上述4组外,另随机抽取6只正常大鼠为正常大鼠组。

4%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,于照射区域标定3cm×3cm大小区域,胰岛素针抽取1ml注射物,进行真皮层内注射,每只大鼠均匀注射20个点,每点注射0.5ml,A-PRP注射组行A-PRP注射,N-PRP注射组行N-PRP注射,生理盐水注射组注射生理盐水,空白对照组及正常大鼠组不注射。

1.2.4 免疫组化法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达:注射4周后,大鼠常规饲养1周,处死后取皮肤标本。SP二步法对Ⅰ、Ⅲ型胶原进行染色,每个标本随机选取3张切片,每张切片高倍镜下观察3个视野,合计每组54个视野。以Image Pro Plus 6.0软件对切片图像进行分析,检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的平均光密度值,取每组平均值进行比较。

1.2.5 Western bolt法检测TGF-β、MMP-1表达:以Image J图像分析软件对各组条带吸光度值进行分析,从而测定TGF-β、MMP-1的表达情况。

1.2.6 统计学分析:所有数据使用SPSS 17.0进行分析处理,计量资料以均数±标准差表示,采用方差分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 大鼠光老化模型建立结果:累计照射60d后,大鼠背部皮肤出现深大的静态皱纹和色素沉着,组织学观察可见大鼠皮肤真皮厚度显著减低,表皮不规则增厚,胶原纤维数量减少、排列紊乱,炎性细胞大量浸润,符合皮肤光老化特征。

2.2 免疫组化检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达结果:各组标本均可见不同程度的Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维染色,胶原纤维染色呈灰褐色。Ⅰ型胶原染色可见,A-PRP注射组改善最为明显,胶原纤维排列规律、紧密;N-PRP注射组优于生理盐水注射组,空白对照组但少于A-PRP注射组;空白对照组和正常大鼠组差异不明显。

Ⅰ型胶原纤维平均光密度值检测结果显示:A-PRP注射组(4.63)高于生理盐水注射组(3.86)、空白对照组(3.94),差异有统计学意义(P<0.01);A-PRP注射组(4.63)高于N-PRP注射组(4.24),差异有统计学意义(P<0.05);A-PRP注射组(4.63)与正常大鼠组(5.07)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

Ⅲ型胶原纤维染色结果变化趋势与Ⅰ型胶原基本相同,A-PRP注射组(4.43)显著高于生理盐水注射组(3.97)、空白对照组(3.94),差异有统计学意义(P<0.01),但A-PRP注射组(4.43)、N-PRP注射组(4.32)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。A-PRP注射组(4.43)与正常大鼠组(4.76)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 Western bolt法检测TGF-β、MMP-1表达结果:通过条带吸光度值分析TGF-β和MMP-1的表达。A-PRP注射组较生理盐水注射组、空白对照组TGF-β表达显著增高(P<0.01),MMP-1表达显著下降(P<0.01);A-PRP注射组较N-PRP注射组TGF-β表达显著增高(P<0.05),MMP-1表达无显著差异(P>0.05);与正常大鼠组比较,A-PRP注射组TGF-β表达无显著差异(P>0.05),MMP-1表达显著增高(P<0.05)。

3  讨论

真皮中的胶原纤维主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维,其中Ⅰ型占80%,是维持皮肤张力的主要部分,Ⅲ型胶原纤维是幼稚的胶原纤维,主要构成网状纤维[9-10]。既往的研究表明,紫外线照射首先可以诱导成纤维细胞和角质细胞表达IL-1、TNF-α等炎症因子,这些炎症因子通过激活NF-κB通路和MAPK通路上调基质金属蛋白酶MMPs的表達。MMPs是一类锌依赖的蛋白酶家族,在细胞外基质的分解和改建中发挥着重要作用。MMP-1可以特异性的将Ⅰ型胶原蛋白初步分解,并且其分解产物也能够抑制Ⅰ型胶原蛋白的表达,因此MMP-1的增加被认为是皮肤光老化过程中的核心环节[7,11-12];其次,紫外线可以造成皮肤组织活性氧ROS堆积,造成细胞的凋亡和DNA的损伤,诱发基因突变甚至皮肤肿瘤的发生;最后,紫外线还能够上调AP-1,抑制TGF-β/Smad通路,TGF-β是抑制皮肤光老化的最主要生长因子之一,TGF-β能够刺激成纤维细胞的增殖,促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和透明质酸的合成,同时TGF-β还能够下调蛋白酶的表达并增强其抑制物的活性,从而减少细胞外基质的降解[13]。

PRP是自体血经过离心后获得的血小板浓缩物,血小板α颗粒内含有TGF-β、PDGF、VEGF、IGF、EGF等大量生长因子和细胞因子,在诱导细胞趋化和新生血管形成、促进细胞增殖分化、增强细胞外基质合成等组织修复环节中发挥着核心作用[14]。当PRP被激活后,α颗粒内的生长因子和细胞因子大量快速释放,在TGF-β等因子的趋化作用下,炎性细胞、成纤维细胞和其他未分化细胞聚集于给药区域,炎性细胞吞噬变性坏死的组织成分,为成纤维细胞和未分化细胞的粘附提供有利环境;成纤维细胞等粘附于基质后,生长因子与细胞表面受体结合,通过信号通路转导,促进细胞的增殖分化并上调Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、透明质酸以及其他细胞外基质成分的合成,增强MMPs抑制物TIMP的表达,抑制MMPs对细胞外基质的降解作用[4]。PRP根据是否通过外源激活物激活可分为A-PRP和N-PRP,在体外,如开放性创面、窦道等使用PRP必须经过激活,而在体内注射PRP是否需要激活仍然存在争议[15]。

本课题中,A-PRP注射组和N-PRP注射组相比生理盐水注射组和空白对照组,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白TGF-β表达显著升高,MMP-1表达显著下降,其中Ⅰ型胶原蛋白和TGF-β表达A-PRP高于N-PRP,而Ⅲ型胶原蛋白和MMPs表达两者无显著差异。综合以上结果,说明PRP能够通过促进光老化皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和TGF-β表达,抑制MMPs表达而对光老化皮肤起到改善作用。

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[收稿日期]2017-12-18

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