吴怡然， 段 娜, 林 聪

(中国农业大学 水利与土木工程学院， 北京 100083)

厌氧消化作为一种环境友好型的清洁能源生产方式，将环境保护和能源回收有机地结合在一起。它是多种微生物共同参与、分阶段有序进行的复杂串联代谢过程，包括水解反应、产酸反应、产乙酸反应、甲烷生成4个阶段。产甲烷菌对环境最敏感、代谢速率最慢，因此，甲烷生成阶段往往是厌氧消化过程的瓶颈，水解酸化与产甲烷两阶段一旦失去平衡，系统内便会表现为有机酸的积累，即系统酸化，随之甲烷生成受阻，二氧化碳分压增大，厌氧消化过程失败[1]。

为保证厌氧消化过程的稳定性，实际工程中，发酵过程倾向于控制在较低的有机负荷[2]，为提高反应底物的发酵效率，实现及时的预警调节，需要对系统进行精准的监控，一套合理的预警指标体系极为关键。过程分析技术(Process Analysis Technology, PAT)的发展提高了监控方法的工艺水平，利用光谱、电化学等技术在线解密复杂的生物转化过程，使得厌氧消化过程控制更加灵敏、快捷，但仍需要一个精确的预警指标来划定界限[3]。

厌氧消化过程失稳的早期预警指标研究受到世界各国的广泛关注，目前厌氧消化系统失稳预警指标主要集中在挥发性脂肪酸(Volatile Fatty Acid, VFA)、碱度及其综合指标、氢气分压、中间代谢产物以及微生物与酶活性等。针对不同的发酵情形，乙酸、氢气和二氧化碳作为甲烷生成的直接前体，通常具有一定的预警性，但对于不易降解的物质，气相指标较为迟缓；从原料成分角度来看，以碳水化合物为主要成分的原料代谢产物中短链VFA的积累最为显著，而以蛋白质为主的原料，氨氮、芳香族化合物、蛋白酶活性等是其特有的指标，脂质含量高时，磷酸酯酶活性也是可能的预警指标。但一套预警指标体系通常只适用于某一种生物质在特定环境条件下的反应，不具备普适性。随着实验测试水平的提升，厌氧消化过程逐渐实现线上实时监控，单一的预警指标被综合性指标取代，大量研究趋向于肯定微生物群体的重要意义而非传统化学指标。本文旨在总结和梳理现有厌氧消化过程失稳预警指标及其特点，预警表征方法、过程监控方法与技术，为厌氧消化过程预警及监控研究提供基础材料。

1 厌氧消化失稳预警指标体系

1.1 VFA，碱度及其综合指标

在厌氧消化过程中，甲烷生成通常有两种途径，一是乙酸分解产生甲烷，二是氢气与二氧化碳反应生成甲烷，其中，乙酸分解途径产甲烷量约占总产甲烷量的70%，而乙酸来源包括直接生成和其他VFA的分解，因而，自预警指标研究之初，VFA及其耦合指标就受到了研究人员的广泛关注。

1995年，Ahring[4]等在中温条件下采用猪粪与牛粪混合物作为底物，采用缩短水力停留时间(Hydraulic Retention Time, HRT)、有机负荷过载、温度变化3种方式进行了VFA作为预警指标的研究，结果表明，3种情形下VFA、丙酸与乙酸的比值都具有较好的预警性能。2010年，Boe[5]等人在中温条件下采用牛粪作为发酵底物，通过添加葡萄糖、脂质、明胶和生物纤维使系统过载，同时进行沼气产量，pH值，VFA等指标的线上、线下监测，结果显示，当系统开始失稳时，乙酸含量快速升高，但随产甲烷反应进行其数值下降亦十分迅速，显示出较大波动，而丙酸变化相对迟缓，但预警性表现最为稳定，因此，研究者提出可综合两项指标共同预警。在较长时间跨度的研究中可发现，不同操作条件下，VFA类指标的具体预警酸种类有所不同，且VFA中部分组成成分的耦合指标相对更加高效。

VFA反应了系统酸化的情况，而碱度标志着系统承受酸化的能力，因此，近年来碱度以及两者的数值关系或综合指标也被认为是可行的预警指标，包括碳酸氢盐碱度总碱度(Total Alkalinity, TA)，(Bicarbonate Alkalinity，BA)，VFA/TA等。在实验研究中，Li[6]等人针对餐厨垃圾中温厌氧消化系统进行了研究，通过缩短HRT进行过载及恢复后二次过载模拟，结果表明，总VFA浓度，VFA/TA，BA/TA的综合指标可有效实现餐厨垃圾厌氧消化过程预警，预警时间从5天到13天。其中，VFA/TA表征着引起系统pH值降低的化合物与保持碱度的化合物之间的比例，可以较好地反映系统继续承受酸化的能力。

针对特定的发酵原料，Kleybocker[7]等人提出了VFA与金属离子浓度耦合的指标，实验采用城市污水与菜籽油进行联合发酵，结果显示，随着进料有机负荷(Organic loading rate, OLR)的提高，总VFA/Ca2+出现预警指示的日期比丙酸指示早6天，此外，丁酸和异丁酸也有较好的预警性。

1.2 气相指标

基于甲烷产生过程理论，氢气分压升高表征着氢气合成甲烷过程受阻，并会导致丙酸的积累，因而具有一定的预警价值。Boe[5]等人在牛粪厌氧消化研究中，通过添加易降解物质提高OLR，验证了氢气的预警性，但在其他研究中，由于原料降解缓慢、气液相转移延迟、溶解氢消耗等问题，氢气分压作为气相指标对于有机负荷的变化并不敏感[7]。但与之相对的，丙酸分解过程中，氢气分压所体现的化学平衡还可以通过丙酸(盐)与乙酸(盐)的比值来体现，而后者作为液相指标相对更加灵敏。

此外，针对目标产物为甲烷的发酵类型，甲烷产量可以直观的显示厌氧消化系统的运行状态，也具有一定的预警性能。

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1.3 其他中间代谢产物

Hecht和Grieh[8]在实验中发现芳香化合物在餐厨垃圾厌氧消化过程中的累积效应，除了已知的有毒代谢物如氨，硫化氢和VFA显著升高外，芳香化合物浓度也随OLR的增大而增加，其主要成分为苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的厌氧降解中间体，在大多数实验中，芳香族化合物特别是苯乙酸，出现波动较之VFA要更早，这表明了使用芳香化合物作为过程失稳预警指标的可能性。此外，还有学者提出用甘油、乳酸等中间代谢产物作为预警指标。

1.4 微生物多样性

厌氧消化系统失稳时，微生物群落将对环境胁迫产生适应性变化。Poirier[9]等人通过投加5 g·L-1苯酚作为毒性物质，破坏厌氧系统稳定性，微生物测序结果显示古细菌和细菌群落在毒性状态下具有高水平适应性，进而提出微生物群落丰度作为预警指标的可能性。Lv[10]等人利用碳14标记产物甲烷，检验碳14的监测作用，同时荧光标记两种产甲烷途径的微生物群落，从而表征甲烷的生成途径，对系统运行状况进行评估。

1.5 酶活性

厌氧消化4个阶段分别有多种酶参与反应，其中，水解过程是厌氧消化过程的开始，同时也是产甲烷的限速步骤[11]，在此过程中，发酵性细菌分泌的水解酶对底物的水解起着关键作用。国内外对厌氧消化中水解酶的研究主要集中在葡萄糖苷酶(Glucosidase)、蛋白酶(Protein Enzyme)、磷酸酯酶(Phosphatase)等[12-15]。 Ugwuanyi[16]等人在对淀粉废水厌氧消化的研究中发现，当系统超负荷运行时，蛋白酶和葡萄糖苷酶的活性明显升高，可作为潜在的评估厌氧消化过程稳定性的监测指标。磷酸酯酶是水解底物上磷酸基团的酶，其活性与磷酸酶产生菌和产酸菌的数量有关，因此也可用以判断消化系统的酸化状态。彭绪亚等在餐厨垃圾厌氧消化失稳研究中发现磷酸酯酶活性骤变较VFAs、容积产气率超前2天，较pH值骤降超前1天[14]。

2 系统预警的表征方法

为确定指标是否达到预警状态，已有研究主要集中在指标临界值的判定，但在实际沼气工程运行中，发酵环境、物料性质等差异性较大，临界值的可参考意义很小，因此指标的预警性能判别与变动显著性检验更为关键。

Angelidaki[4]等提出了一种简单的显著性评估方法，通过计算指标变化幅度：Z值，判别指标是否发生质的跃变。此外，多项指标综合判定对系统酸化状况评估具有重要意义，Cook[17]等人设计出了一种回归分析的方法，量化表现系统运行状态，值域在0到1之间，并划定0.5为显著失稳的临界值。

更多的研究者倾向于直观的从数值变化曲线来判断指标变动情况，并与厌氧消化系统产气潜能或甲烷产量曲线进行比较，从而判别指标变动日期与系统崩溃日期，进而对预警时间进行计算。

3 厌氧消化过程监控方法与技术

为实现厌氧消化过程的长期稳定进行，需实时监测过程各项指标波动，为可能的运行风险提供预警。过程指标测试方法的不断优化为及时、快速的监控提供基础。表1对应用于厌氧消化过程监测的常用测试方法进行了比较。

表1 厌氧消化过程监控常用测试方法比较

3.1 滴定法

比对各种监测方法，滴定法具有简单易行、低成本的优势。针对VFA积累引起的厌氧消化过程失稳，Feitkenhauer[18]等人提出了一种定量滴定短链挥发性脂肪酸(Short Chain Volatile Fatty Acids, SCVFA)的方法，该方法无需过滤，直接使用测量池滴定，计算机基于预设的VFA浓度自动调整滴定程序；通过模拟不同浓度、成分的工业废水发酵，测试该方法的有效性，实验数据显示废水浓度及成分的变化对检测效果无显著影响。

但是，滴定法在一些应用中误差较大，需对计算方法进行修正。刘芳等[20]采用Nordmann联合滴定法和精密仪器法对一项以OLR为变量的连续发酵实验的总VFA与BA变化进行了测定，比对两者测定结果发现，Nordmann联合滴定法测定的VFA与BA质量浓度均值相对误差均在50% 以上，且随有机负荷的提高，相对误差率降低。

3.2 色谱法

色谱法利用不同相态中，物质的选择性分配原理，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同物质以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。依流动相的不同分为气相色谱、液相色谱等。该方法用于测定厌氧消化过程中间产物时，存在着易结垢、堵塞的问题[3]。Boe[21]等人开发设计了一种顶空气相色谱的方法，利用一个样品预处理池，通过调节温度、pH值和离子浓度，降低样品中挥发性化合物溶解度，并对顶空气相进行取样，利用溶解度关系确定个体VFA的浓度，该方法无需过滤，且不易导致堵塞。

3.3 红外光谱与近红外光谱

红外光谱与近红外光谱分析法均利用不同物质选择性吸收红外光区电磁辐射的原理进行化学过程监测。分子中不同的化学键或官能团吸收辐射的频率不同，将红外吸收光谱与标准图谱进行比对可对物质进行定性，分析吸收峰位置及强度可对物质进行定量。该方法对试样无破坏、用量少，且操作简便、快捷。Steyer[22]等人在实际发酵工程运行中验证了红外光谱法测定VFA，COD，TOC，TA，PA的可行性，但其技术瓶颈在于必须配备一个超滤设备配合使用，解决方案即研究开发超滤设备的经济替代物。Holm-Nielsen[23]等人在甘油作为添加剂的厌氧发酵研究中，采用了近红外光谱分析测定VFA和甘油的含量，并认为该方法具有较好的精密度与重现性。

3.4 荧光法

利用荧光标记某些特定物质，比对标准荧光光谱，可进行定性、定量的分析，在厌氧消化过程研究领域，常用于标记还原性辅酶Ⅰ(Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NADH)及一些辅酶。其中，NADH直接与生物代谢活动相关，其变化状况可以表征出厌氧微生物的活性，Peck 和Chynoweth[24]在实验中发现，当反应OLR过载时，荧光是最敏感的预警指标。辅酶F420是产甲烷菌特有的辅酶，赵全保[25]在人工合成废水发酵的研究中，对反应物进行了OLR改变过程中的三维荧光分析，实验结果显示辅酶F420荧光峰对发酵酸败现象显示出较好的预警效果。

3.5 其他

利用水的介电常数与电磁波频率变化关系，微波可用以检测物质水分含量[26]，Nacke[27]等人利用这一性质提出了一种干物质定量系统，系统测量范围为干物质2%～14%，研究者还依据实验数据建立了单变量和多变量模型，用以监控厌氧消化反应器性能。

同位素追踪法配合色谱法或质谱法检测也曾被研究者用以厌氧消化过程研究。Polag[28]等利用碳14标记产物甲烷，检验了碳14的监测作用，实验显示，在连续高OLR条件下，碳14值的早期指示性较差，但稳定同位素值与微生物分析的数据比较显示，主要甲烷生成途径和碳同位素值之间有一定关联，该发现可作为碳同位素追踪法监控厌氧消化的理论基础。

传感器的应用有力的推动了线上监测厌氧消化过程的研究进展，Rudnitskaya和Legin[29]综述了电子舌与电子鼻运用于生物反应过程监控的可能性，近年多变量方法的运用改善了传统传感器阵列低选择性的问题，加之传感器的廉价与坚固性使它们在监控复杂生物反应过程中具有一定优势。但是，由于化学环境和采样方法导致的管道结垢堵塞、样品测试过程中降解等常见问题尚待科学研究。

4 总结与展望

4.1 预警指标体系的完善

从表2不同原料厌氧消化预警指标研究结果来看，各项指标中没有一个指标是普适性的，针对不同的消化底物、运行条件，其预警性能显示出不稳定性，如，Pullammanappallil[30]等认为丙酸作为预警指标时的临界值为2750 mg·L-1，Nielsen[31]等提出的临界值为1500 mg·L-1，而Kleybocker[7]等人在研究中发现丙酸并没有出现较早的积累。此外，已有研究主要集中在以餐厨、禽畜粪便及废水为底物的发酵过程，针对纤维素类生物质为底物的厌氧消化预警研究几乎空白，不同工业产生废水、多种底物混合发酵等众多底物类型都亟待继续探究，因此在未来的研究中，研究人员可针对不同类型的原料开展相关研究共同完善预警指标体系，这对于实际生产有着重要的指导意义。

4.2 适宜指标筛选

综合文献中所述，一个适宜的预警指标应具备3项显著特征：

(1)易于测量，测试周期短。微生物活性、酶活性等都显示出较好的预警性能，且更加深入的表征出厌氧消化系统的运行环境，但在实际运用中相对测试难度较高，测试周期长，因而在实用性角度，VFA、碱度等指标有着明显的优势。

表2 不同原料厌氧消化指标

(2)稳定性。多项指标在实验中被证明虽然具有预警性，但数值波动大，实用性差，比如，乙酸具有较高的预警灵敏性，在短时间内可大量富集，但随着反应的进行，乙酸直接分解产甲烷导致浓度锐减，预警状态持续时间短，预警不稳定，难以判别系统内真实的酸化状况[32]。

(3)灵敏性。最佳的预警指标体系应在物料滞留期内提供足够长的预警时间，预警时间即某一参数表现出警示性到系统开始崩坏之间的时间间隔。

4.3 数据处理与建模

基于预警指标及临界值的判断，运用数学的方法统一标准化各项备选指标的数值，建立厌氧消化过程模型，可以更加科学、直观地为精准生产监控服务。生化反应模型是在线过程控制方法的核心，目前可以较好的模拟厌氧消化过程的功能模型主要为国际水质协会提出的ADM1模型及其他学者提出的在某些特定情形下的变型。因此未来的研究发展方向可利用数学建模更加深入的揭示厌氧消化反应过程，为全面、快捷的在线监控提供理论支柱。