，，

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)俗称绿脓杆菌，广泛分布于自然界、人体皮肤与肠道以及多种医疗器械表面[1-2]。铜绿假单胞菌是常见机会致病菌(opportunistic pathogen)，也是引起医院感染主要病原菌之一[2-5]。有文献报道，铜绿假单胞菌感染引起的疾病类型复杂多样，但以肺部感染最为常见[6-9]。此外，铜绿假单胞菌对多种临床常用抗生素天然耐药[10-12]。为了解不同疾病铜绿假单胞菌的感染状况以及该菌对临床常用抗菌药物的耐药性，我们对2017年本院急诊或住院细菌性感染病人标本中铜绿假单胞菌进行了分离鉴定并检测和分析了分离菌株的耐药性，另选择仅检出铜绿假单胞菌的患者进行了年龄和性别与易感性、所致疾病类型、病人临床科室来源等进行了分析，以期为更有效地诊治铜绿假单胞菌感染性疾病提供依据。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集859例2017年1—12月来本院急诊或住院感染性疾病病人痰液、腹水、尿液、切口分泌物或血液等标本。

1.2细菌分离培养 根据《全国临床检验操作规程》第4版规程[13]，将不同临床标本分离划线接种图血平板(法国生物梅里埃)和巧克力平板(法国生物梅里埃)上，倒置平板在5% CO2环境中37 ℃培养18～24 h，以获得单个菌落。

1.3细菌鉴定 根据《全国临床检验操作规程》第4版规程[13]，单个菌落增菌培养后采用VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定仪(法国梅里埃)公司及GN鉴定卡进行鉴定。

1.4PCR 采用铜绿假单胞菌16S RNA基因特异性引物和EX-Taq高保真PCR试剂盒(TaKaRa，大连)[14]，对标本中仅有铜绿假单胞菌的分离出鉴定进行PCR检测。采用细菌基因组DNA提取试剂盒(Axygen，USA)提取各铜绿假单胞菌分离株基因组DNA，紫外分光光度法测定其浓度和纯度[15]。上游27F引物序列：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游1492R引物序列：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。引物由上海Invitrogen公司合成。PCR参数如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s进行35个循环，72 ℃ 10 min。采用溴乙锭预染色的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，铜绿假单胞菌特异性扩增片段大小为1425 bp[14]。PCR中以铜绿假单胞菌ATCC27853株为对照。

1.5药物敏感试验 根据《全国临床检验操作规程》第4版规程[13]，采用法国生物梅里埃公司VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定仪及AST-GN药敏卡，检测上述铜绿假单胞菌临床分离菌株对14种抗菌药物的敏感性。根据美国临床标准化委员会(CLSI)规程[16]，采用K-B纸片扩散法检测铜绿假单胞菌临床分离菌株对美诺培南、米诺环素、哌拉西林的敏感性。上述药物敏感试验中，铜绿假单胞菌ATCC27853株作为质控菌株。根据CLSI标准判读药物敏感试验结果[16]。

1.6多重耐药模式分析 根据文献，铜绿假单胞菌多重耐药是指该菌对3类及以上不同类型至少1种抗菌药物耐药，其中β-内酰胺类抗生素又分为青霉素、头孢菌素和碳青酶烯3类[17]。根据上述标准，对铜绿假单胞菌临床菌株多重耐药模式进行分析。

1.7统计分析 采用卡方检验分析铜绿假单胞菌临床分离菌株对不同抗菌药物的耐药率和多重耐药模式，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1铜绿假单胞菌PCR检测结果 199例铜绿假单胞菌基因组DNA中，均能扩增出预期大小的目的基因片段(1 425 bp)，表明VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定仪及GN鉴定卡鉴定结果可靠(图1)。

M：分子量marker；1：空白对照；2：铜绿假单胞菌ATCC27853株扩增条带(对照)；3～6：4株铜绿假单胞菌临床分离代表株扩增条带

2.2铜绿假单胞菌所致疾病类型 199例铜绿假单胞菌感染病人中，以肺炎等下呼吸道感染最为常见(35.7%，71/199)(χ2=24.8,P<0.05)，其次为皮肤感染(14.1%，28/199)、腹腔感染(13.1%，26/199)、泌尿道感染(13.1%，26/199)、上呼吸道感染(10.0%，20/199)和胆道感染(7.5%，15/199)(χ2=4.0,P<0.05)，耳道、血液和其他感染仅占7.5%(15/199)(表1)。

表1 铜绿假单胞菌感染性疾病类型及其构成比Tab.1 Types and constituent ratios of P. aeruginosa-infected diseases

2.3性别与年龄对铜绿假单胞菌感染率的影响 199例铜绿假单胞菌感染病人中，62.8%(125/199)为男性，37.2%(74/199)为女性，男性更易感(χ2=26.1,P<0.05)。病人年龄范围22～97岁，其中69.3%(138/199)病人≥60岁、21.1%(42/199)病人41～59岁、9.6%(19/199)病人20～40岁，≥60岁人群更易感(χ2=59.5,P<0.05)；各病种中泌尿系统、下呼吸道和皮肤感染率相对较高(>70%)，但20～40岁病人耳道感染较为常见(表2)。

2.4铜绿假单胞菌感染病人临床科室分布 199例铜绿假单胞菌感染患者中，27%(54/199)来自重症监护病房、26%(51/199)来自普外科，多于其他科室(χ2=17.7,P<0.05)(表3)。

2.5铜绿假单胞菌临床菌株耐药性 药物敏感试验结果显示，199株铜绿假单胞菌临床菌株对妥布霉素和丁胺卡那霉素敏感率分别为95.48%和93.47%，其次为庆大霉素(88.44%)、左旋氧氟沙星(72.36%)和哌拉西林(70.51%)，但对复方新诺明、头孢唑林、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、米诺环素、头孢曲松耐药率较高，分别为99.50%、98.99%、98.48%、97.99%、97.80%和95.48%(表4)。

表3 铜绿假单胞菌感染病人临床科室分布Tab.3 Distribution in clinical departments of P. aeruginosa-infected patients

表4 铜绿假单胞菌临床菌株药物敏感试验结果Tab.4 Results of drug sensitivity test of P. aeruginosa isolates

2.6铜绿假单胞菌临床菌株多重耐药模式 四环素类米诺环素和磺胺类复方新诺明临床使用较少。除米诺环素和复方新诺明外，55.3%铜绿假单胞菌临床分离菌株(110/199)株多重耐药，多重耐药模式复杂多样，其中30.9%(34/110)菌株对青霉素+头孢菌素+碳青霉烯类耐药，39.1%(43/110)菌株对青霉素+头孢菌素+碳青霉烯+喹诺酮类耐药，为铜绿假单胞菌优势多重耐药模式(χ2=25.1,P<0.05)(表5)。

3 讨 论

铜绿假单胞菌为革兰阴性杆菌，分布广泛，是最为常见的机会致病菌和医院感染病原菌之一。尽管铜绿假单胞菌感染所致疾病复杂多样，但国内外研究报道，肺炎是铜绿假单胞菌感染所致主要疾病[18-20]。本研究中，高达35.7%病人为铜绿假单胞菌下呼吸道感染，其中66例为肺炎、5例为慢性阻塞性肺病，气管插管和气管切开后使用呼吸机等有创医疗措施增加了铜绿假单胞菌下呼吸道感染风险，与国内外文献报道一致。值得关注的是，本研究中分别有14.1%、13.1%和12.1%病人分别为铜绿假单胞菌皮肤、腹腔和泌尿道感染，皮肤感染者多有下肢静脉曲张所致慢性溃疡、腹腔感染者多为腹腔镜术后感染、泌尿道感染者多发生于膀胱切除术或更换输尿管支架后。上述资料提示，在医院日常医疗工作中，加强环境空气和医疗器材消毒、减少和治愈皮肤损伤、加强术中消毒并在术后预防性使用抗菌药物，是降低铜绿假单胞菌感染的有效措施。

表5 绿假单胞菌临床菌株多重耐药模式Tab.5 Multidrug resistance models of P. aeruginosa isolates

本研究中发现，69.3%铜绿假单胞菌感染病人为≥60岁老年人群，疾病类型以泌尿道、下呼吸道和皮肤感染常见。众所周知，老年人机体免疫力显著下降，易发生正常菌群所致的机会性感染[21-22]。此外，铜绿假单胞菌感染病人在不同临床科室中的分布存在明显差异，ICU(27.1%，54/199)和普外科(25.6%，51/199)铜绿假单胞菌感染病人多于其他临床科室(P<0.05)，前者多为下呼吸道感染(39/54)，后者多为皮肤和腹腔感染(14+22/51)，这可能与ICU病人因病情重以及抵抗力弱且常施行气管插管或气管切开、普外科病人通常进行手术有关。上述资料提示，加强老年人群个人卫生并提高机体免疫力、侵入性医疗时特别注意无菌操作并加强消毒措施，是减少铜绿假单胞菌感染率的针对性措施。

与其他临床常见病原菌比较，铜绿假单胞菌具有较强的耐药性，不仅对多种抗菌药物天然耐药，且其耐药机制也复杂多样[23-24]。根据分子结构和抗菌机制不同，临床常用抗生素分别为β-内酰胺类(青霉素类哌拉西林和氨苄西林等、一代头孢菌素类头孢唑林等、三代头孢菌素类头孢他啶和头孢曲松等、四代头孢菌素类头孢吡肟等、碳青酶烯类美罗培南和亚胺培南等)、氨基糖苷类(丁胺卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素等)、喹诺酮类(环丙沙星、左旋氧氟沙星等)和大环内酯类(红霉素等)。我们的药物敏感试验结果显示，铜绿假单胞菌临床菌株对氨苄西林、头孢唑林和头孢曲松耐药率高达95.48%～98.99%，但对哌拉西林和头孢吡肟耐药率分别仅为28.21%和26.13%，这可能与哌拉西林为抗菌作用较强的半合成青霉素、头孢吡肟为最新的四代头孢菌素有关。产生β-内酰胺酶是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制，他唑巴坦和舒巴坦均为β-内酰胺酶抑制剂[25]。本研究中发现，铜绿假单胞菌临床菌株对哌拉西林和氨苄西林耐药率分别为28.21%和98.48%、对哌拉西林/他唑巴坦和氨苄西林/舒巴坦耐药率分别为27.13%和97.99%，未能明显降低细菌对哌拉西林和氨苄西林的耐药性，提示上述铜绿假单胞菌临床菌株对哌拉西林和氨苄西林耐药可能与β-内酰胺酶无关。更为重要的是，55.3%铜绿假单胞菌临床菌株对临床常用抗生素多重耐药，其主要多重耐药模式为青霉素+头孢菌素+碳青霉烯类和青霉素+头孢菌素类+碳青霉烯+喹诺酮类。上述资料提示，铜绿假单胞菌临床菌株耐药性强且多重耐药率较高，故对铜绿假单胞菌感染病人分离菌株并进行药物敏感试验极为必要，以期为选择敏感或相对敏感菌抗生素以及联合用药提高铜绿假单胞菌治疗效果提供依据。