赵晶，刘诗伟，杨雨欣，罗佳，谢婧，廉文静

（天津农学院基础科学学院，天津 300384）

氨苄西林是一种应用广泛的β-内酰胺类抗生素，常用于家畜养殖中预防和治疗细菌感染，以加快家畜生长发育，提高产量［1-2］。在家禽养殖中滥用氨苄西林可能会导致其在动物源食品中的残留，对人类健康造成危害［3］。因此，实现食品中氨苄西林残留高效、灵敏测定对保护人类健康非常重要。

分子印迹技术是合成对目标分析物具有特异性识别作用的分子印迹聚合物（MIP）的分子识别技术［4-6］。MIP具有稳定性好、选择性高及可预定性等优点，在电化学检测方面，将MIP良好的特异选择性与简便、快速的电化学检测方法结合构建分子印迹电化学传感器已广泛应用于分析化学及其它研究领域［7-8］。其中，电流型分子印迹电化学传感器是应用最广泛、研究最成熟的一种电化学传感器，然而，洗脱后有限的特异性识别位点数量以及较差的导电性大大限制了电流型分子印迹电化学传感器的检测灵敏度［9］。因此，利用简单高效的方法提高电流型分子印迹电化学传感器的检测灵敏度，实现对目标分析物的快递、灵敏测定具有非常重要的应用价值。

近年来，一些具有优良特性的纳米材料常被用作电极修饰材料，以提高分子印迹电化学传感器的检测灵敏度［10-12］。石墨烯作为一种新型的碳纳米材料，由于其优良的导电性，较大的比表面积和非凡的机械性能［13-15］，在电化学传感领域引起了很大的关注，使其成为一种应用广泛的电极修饰材料。同时，具有导电性好、生物相容性好、比表面积大等性质的金纳米粒子（AuNPs）也被广泛应用于电化学传感器的构建［16-17］。但石墨烯和AuNPs通常利用化学还原法还原氧化石墨烯（GO）及氯金酸制备，制备过程较复杂，且需加入强还原剂，带来污染［18］。利用电化学沉积法，在合适的电位下，可在常温常压条件下一步实现氯金酸和GO的还原，直接在电极表面沉积AuNPs-rGO复合材料，具有制备过程高效、可控等优点。由于石墨烯和AuNPs的协同信号放大作用，AuNPs-rGO复合材料比单一纳米材料具有更好的电化学性能。

本文利用简单、高效、可控的电沉积法在玻碳电极（GCE）表面制备AuNPs-rGO复合材料，并以氨苄西林为目标分子，邻苯二胺为功能单体，在AuNPsrGO/GCE表面电聚合制备分子印迹聚合物，构建氨苄西林电化学传感器。研究AuNPs-rGO复合材料的电化学性质以及氨苄西林电化学传感器的性能参数，以评估电沉积法制备AuNPs-rGO复合材料的制备工艺及其在电化学传感器中的应用价值。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

仪器：CHI 660E型电化学工作站；三电极系统：以GCE电极为工作电极，以铂丝电极和饱和甘汞电极分别为对电极和参比电极；KH5200B型超声波清洗仪。

试剂：主要包括氨苄西林，氯金酸，邻苯二胺，铁氰化钾，无水甲醇，冰醋酸，醋酸钠，铁氰化钾，亚铁氰化钾，氯化钾等，以上试剂均为分析纯；GO采用Hummers法自制；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 AuNPs-rGO/GCE电极制备

将GO分散到蒸馏水中，超声震荡1 h，得到1 mg·mL-1GO分散液。用移液器移取10 μL GO分散液到Al2O3粉抛光处理后的GCE电极表面，置于红外灯下烘干。以GO/GCE电极为工作电极构建三电极系统，置于1 mmol·L-1氯金酸溶液中，-1.0 V恒电位沉积250 s，得到AuNPs-rGO/GCE电极。

1.3 氨苄西林分子印迹电化学传感器构建

以AuNPs-rGO/GCE电极为工作电极构建三电极系统，置于含5 mmol·L-1氨苄西林和10 mmol·L-1邻苯二胺的pH 5.2的0.1 mol·L-1醋酸盐缓冲液中进行循环伏安扫描，扫描电位为0～0.8 V，扫速为0.05 V·s-1，电聚合30圈得到氨苄西林MIP/AuNPsrGO/GCE电极。在室温晾干后，将MIP/AuNPsrGO/GCE电极置于20 mL甲醇/乙酸（9∶1，V/V）溶液中磁力搅拌15 min洗脱掉氨苄西林，用蒸馏水冲洗后室温晾干便得到洗脱后的MIP/AuNPs-rGO/GCE电极，该电极对氨苄西林具有特异识别作用。将洗脱后的MIP/AuNPs-rGO/GCE电极浸入到不同浓度的氨苄西林溶液中20 min，室温干燥得到重结合后的MIP/AuNPs-rGO/GCE电极。非印迹聚合物（NIP）采用相同步骤在相同条件下制备，只是在制备过程中不加入模板分子氨苄西林。

作为对照组，直接在抛光后的裸GCE电极表面电聚合氨苄西林MIP膜，得到氨苄西林MIP/GCE电极，除未在GCE电极表面电沉积AuNPs-rGO复合材料外，其余实验条件与制备氨苄西林MIP/AuNPsrGO/GCE电极相同，以研究AuNPs-rGO复合材料对氨苄西林检测灵敏度的提高作用。

1.4 测试与表征

循环伏安曲线和电化学阻抗谱均利用CHI 660E型电化学工作站测定。循环伏安曲线测定以5 mmol·L-1K3Fe（CN）6溶液（含0.1 mol·L-1KCl）为探针，扫描电位为-0.2～0.6 V，扫速为0.1 V·s-1；电化 学 阻 抗 谱 测 定 在5 mmol·L-1K3Fe（CN）6和K4Fe（CN）6（1∶1，含0.1 mol·L-1NaCl）混合溶液中测定，频率范围为0.1～105Hz，电压为0.17 V。

2 结果与讨论

2.1 电沉积AuNPs-rGO复合材料条件优化

为了得到导电性能好、稳定、均匀的AuNPsrGO复合材料，对两种常用的电沉积方法进行优化。分别采用I-T曲线法和循环伏安法制备AuNPs-rGO复合材料，首先在GCE电极表面修饰10 μL 1 mg·mL-1GO分散液，并置于红外灯下烘干得到GO/GCE电极，以GO/GCE电极为工作电极构建三电极系统，置于1 mmol·L-1氯金酸溶液中进行电沉积。分别对两种沉积方法的电位和时间进行优化后，确定I-T曲线法沉积电位为-1.0 V，沉积时间为250 s，扫速为0.1 V·s-1，循环伏安法电位扫描范围为-1.0～0 V，扫描圈数为15圈，扫速为0.1 V·s-1。在K3Fe（CN）6探针溶液中采用循环伏安法分别测定预处理后的GCE电极、GO/GCE电极以及两种电沉积方法制备的AuNPs-rGO/GCE的电化学性质。如图1所示，K3［Fe（CN）6］探针在裸GCE电极表面有可逆的氧化还原峰（曲线a），说明GCE电极预处理效果很好。GO/GCE电极的电流响应比裸GCE电极略小（曲线b），这是因为GO的导电性能较差。采用循环伏安法（曲线c）和I-T曲线法（曲线d）制备的AuNPs-rGO/GCE电极的电流响应均明显比GCE电极大，说明制备的AuNPs-rGO复合材料可有效促进K3［Fe（CN）6］探针的电子传递。如曲线d所示，采用I-T曲线法电沉积制备的AuNPs-rGO/GCE电极的电流响应更大。

进一步采用电化学阻抗谱对两种电沉积方法制备的AuNPs-rGO/GCE电极的电化学性质进行表征。如图2所示，曲线a～d分别为裸GCE电极，GO/GCE电极，利用循环伏安法制备的AuNPs-rGO/GCE电极，利用I-T曲线法制备的AuNPs-rGO/GCE电极的电化学阻抗谱，可知，电化学阻抗谱测定结果均与循环伏安测定结果（图1）一致，采用I-T曲线法电沉积制备的AuNPs-rGO/GCE电极的电化学阻抗谱表现出最小的半圆直径（曲线d），同样说明采用I-T曲线法电沉积制备的AuNPs-rGO/GCE电极促进电子传递作用最强，且I-T曲线法电沉积过程仅需要250 s，用时更短，因此选用I-T曲线法电沉积AuNPsrGO复合材料。

图1 不同电极的循环伏安曲线Fig.1 Cyclic voltammetry curves of different electrodes

图2 不同电极的电化学阻抗谱Fig.2 Electrochemical impedance spectroscopy curves of different electrodes

2.2 传感器构建条件优化

采用电化学聚合方法，以常用电聚合单体邻苯二胺为功能单体，以氨苄西林为模板分子，在AuNPs-rGO/GCE电极表面制备氨苄西林MIP膜，为得到更好的氨苄西林检测效果，分别对功能单体与模板分子比例，电聚合圈数，洗脱剂及洗脱时间，重结合时间等实验条件进行优化选择。同时参照以邻苯二胺为功能单体电聚合制备MIP的文献报道常用参数［19-20］，确定电化学聚合条件如下：以AuNPsrGO/GCE电极为工作电极构建三电极系统，置于含有5 mmol·L-1氨 苄 西 林 和10 mmol·L-1邻 苯 二 胺 的pH 5.2的0.1 mol·L-1醋酸盐缓冲液中进行循环伏安扫描，在0～0.8 V，以0.05 V·s-1扫描速率，电聚合30圈后在AuNPs-rGO/GCE电极表面得到氨苄西林MIP膜，即MIP/AuNPs-rGO/GCE电极。洗脱剂为甲醇/乙酸（9∶1，V/V），洗脱时间为15 min，重结合时间为20 min。电聚合过程循环伏安曲线如图3所示，电聚合第一圈时，在0.6 V左右得到邻苯二胺单体的不可逆氧化峰，随着聚合圈数逐渐增加，该氧化峰电流逐渐降低，当聚合圈数增加到30圈时，该氧化峰完全消失。这些实验结果说明包埋有模板分子氨苄西林的聚邻苯二胺薄膜已成功聚合在AuNPsrGO/GCE电极表面，并且阻碍了邻苯二胺单体进一步到达电极表面发生氧化还原反应。

图3 电聚合氨苄西林分子印迹聚合物循环伏安图Fig.3 Cyclic voltammetry curves of ampicillin molecularly imprinted polymer by electropolymerization

2.3 传感器构建过程电化学表征

采用K3［Fe（CN）6］作为电活性探针，通过循环伏安法对氨苄西林分子印迹电化学传感器的构建过程进行表征，以验证传感器构建效果。如图4曲线A所示，K3［Fe（CN）6］探针在裸GCE电极表面有可逆的氧化还原峰。当在GCE电极表面电沉积AuNPs-rGO复合材料后，AuNPs-rGO/GCE电极 的电流响应明显增大（图4，曲线B），这是因为一步电沉积法制备的AuNPs-rGO复合材料具有导电性能好、比表面积大等优点，促进了K3［Fe（CN）6］探针的电化学传递过程。如图4曲线C所示，当在AuNPsrGO/GCE电极表面电聚合一层MIP薄膜后，得到的MIP薄膜电极的电流响应明显降低，这是因为电极表面的MIP薄膜较紧密，阻碍了K3［Fe（CN）6］探针分子穿过薄膜到达电极表面发生氧化还原反应。当用洗脱剂洗脱掉氨苄西林后，K3［Fe（CN）6］的氧化还原峰电流明显增大（图4，曲线D），这是因为洗脱掉模板分子后，MIP薄膜中暴露出氨苄西林的特异性识别位点，多孔结构的MIP薄膜有利于K3［Fe（CN）6］探针分子穿过到达电极表面发生电子转移。如图4曲线E所示，当洗脱后的MIP/AuNPsrGO/GCE电极重结合0.1 mmol·L-1氨苄西林后，电极的电流响应明显降低。这是因为重结合氨苄西林后，MIP薄膜中氨苄西林的特异性识别位点被占据，降低了MIP薄膜的孔隙度和渗透率，并且电流响应降低的程度与重结合的氨苄西林浓度有关。从图4检测结果表明，该MIP薄膜可以用来识别氨苄西林，可以利用洗脱后及重结合氨苄西林后的循环伏安响应差值对溶液中的氨苄西林进行定量分析。

图4 K3［Fe（CN）6］在不同电极上的循环伏安曲线Fig.4 Cyclic voltammetry curves of K3［Fe（CN）6］at different electrodes

2.4 标准曲线

配制浓度范围为1×10-9～5×10-3mol·L-1的氨苄西林标准溶液，并将洗脱后的MIP/AuNPs-rGO/GCE电极置于不同浓度的氨苄西林标准溶液中，重结合20 min后自然晾干。以重结合氨苄西林标准溶液后的电化学传感器为工作电极，在K3［Fe（CN）6］探针溶液中进行循环伏安测定后记录K3［Fe（CN）6］的氧化峰电流Ipa，以K3［Fe（CN）6］探针在洗脱后的MIP/AuNPs-rGO/GCE电极上的氧化峰电流为背景电流I0，记录氨苄西林标准溶液的浓度c与ΔIpa（I0-Ipa）的关系，并绘制如图5a所示的标准曲线，得到传感器的线性方程为：ΔIpa（μA）=1.1214（μA）+1.4461c（μmol·L-1）（r=0.997），线 性 范 围 为3.00×10-9～7.00×10-6mol·L-1，灵敏度为1.4461 μA/（μmol·L-1），最低检出限为1.26×10-9mol·L-1（S/N=3）。随着氨苄西林浓度逐渐增大，NIP传感器的ΔIpa均约为0，这是因为NIP传感器没有氨苄西林的特异性识别位点，不能选择性识别氨苄西林。

为研究电沉积制备的AuNPs-rGO复合材料对氨苄西林检测灵敏度的影响，用同样的方法直接在裸GCE电极表面电聚合氨苄西林MIP膜，得到氨苄西林MIP/GCE电极，用于1×10-9～5×10-3mol·L-1氨苄西林标准溶液测定，得到如图5b所示的标准曲线，传感器的线性方程为：ΔIpa（μA）=1.12054（μA）+0.18391c（μmol·L-1）（r=0.993），线 性 范 围 为7×10-8～5×10-5mol·L-1，检测灵敏度为0.18391 μA/（μmol·L-1），检出限为6.35×10-8mol·L-1（S/N=3）。由此可知，在GCE电极表面电沉积AuNPs-rGO复合材料可有效提高传感器的检测灵敏度。

图5 三种传感器的标准曲线Fig.5 Calibration curves of three sensors

2.5 传感器的选择性研究

为研究该分子印迹电化学传感器对氨苄西林的特异选择性，选择氨苄西林的两种结构类似物阿莫西林和头孢氨苄作为干扰物。利用洗脱后的MIP/AuNPs-rGO/GCE电极分别对3.00×10-6mol·L-1氨苄西林及3.00×10-5mol·L-1阿莫西林和头孢氨苄进行测定，如图6所示，该分子印迹电化学传感器对氨苄西林的电流响应ΔIpa明显比其它两种干扰物质的电流响应高，说明该传感器对氨苄西林具有很高的选择性。这是因为洗脱后的MIP薄膜电极产生的立体孔穴的大小和形状都与氨苄西林匹配，它们之间的特异性相互作用发挥了重要的作用。

图6 传感器的选择性Fig.6 The selectivity of the sensor

2.6 传感器的再现性及稳定性研究

为研究该传感器的再现性，在相同实验条件下用相同方法制备3个氨苄西林分子印迹电化学传感器，并用它们检测3.00×10-6mol·L-1氨苄西林，经过反复洗脱和检测三次后，得到的相对标准偏差为4.9%，说明该传感器具有良好的再现性。

传感器的储存稳定性是评估其实际应用性的一个重要参数。将制备的3个传感器室温放置两周后，用它们检测3.00×10-6mol·L-1氨苄西林，发现该传感器的电流响应约为其初始电流响应的92%，说明该传感器有很好的储存稳定性。

3 结语

通过电沉积条件优化，在GCE电极表面一步电沉积制备AuNPs-rGO复合材料，电沉积过程简单、可控、高效，制得的AuNPs-rGO/GCE电极具有良好的电化学性质、稳定性和重现性。将AuNPs-rGO复合材料的优良性质与具有特异选择性的MIP相结合，构建检测灵敏度高、选择性好、稳定性强的氨苄西林电化学传感器。该传感器的检测灵敏度是利用裸GCE电极构建的传感器检测灵敏度的7.86倍，说明一步电沉积法制备AuNPs-rGO复合材料在电化学传感器构建方面具有较高的应用价值。